山大生化实验报告实验五、实验六纤维素酶活力测定、还原糖浓度

1、实验五 纤维素酶活力测定(3,5二硝基水杨酸法)实验六3,5 二硝基水杨酸法测还原糖姓名：周超 同组者：刘炳煜 班级：11级生命基地 学号：201100140067【实验目的】1、学习用3,5二硝基水杨酸法测定述原糖的方法2、学习川3,5二硝棊水杨酸法测定纤维素酶活力【实验原理】1、3,5-二硝基水杨酸法测纤维素齣活力的原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维素二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5二硝基水杨酸中硝基还原成橙色的氨基化合物，利用比色法测定还原物生成虽来表示酶的活力。2、3,5-二硝垄水杨酸法测还原糖的原理述原糖在碱性条件卜加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5二硝基水杨酸则被还原成棕红 色的3氨

2、基5硝基水杨酸。在过量的naoh碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm处有 最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利川比色法可以测定样 品中还原糖的含量。【实验材料】一、器材比色管、水浴锅、电炉、分光光度计、容量瓶100ml、烧杯、移液枪二、试剂1、标准葡萄糖溶液(l.omg/ml)：准确称取干燥悝重的窗萄糖loomg,溶于蒸镭水并定容至 100ml,混匀,4° c冰箱中保存备用。2、3,5二硝基水杨酸试剂：称取10克3,5二硝基水杨酸，溶入蒸憎水中，加入20克分析纯 氢氧化钠，200克酒石酸钾难，加水500亳升，升温溶解麻，加入重蒸酚3克，无水亚硫酸 钠0.

3、5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000 «升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。3、0摩尔ph4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液4、0.5%竣甲基纤维索钠(cmc)水溶液，溶解后成胶装液，潍置过夜，使用前摇匀。5、西瓜汁6 酶液(l()ug/ml) 一、纤维索酶活力测定(3,5二硝基水杨酸法)1、标准曲线的绘制：分别吸収0.0,020.4,0.6,0.&1.0亳升的葡萄糖于6支试管中(分别记为1.2.3.4.5.6）,均川蒸係水稀释至1毫升，加3,5二硝基水杨酸显色剂3毫升，在沸水浴 中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸谓水定容至25毫升，摇匀。在550nm处比色，以光密 度为纵坐标，以

4、葡萄糖微克数为横坐标，绘制标准1111线。2、样品的测定：空白管（记为a。）：取lml酶液与比色管中，沸水浴中溶5min,冷却后加3ml的0.5%cmc, 与样品管同时放入水浴锅中5（）度保温30niino其他操作同样品管。样品管（记为a, a2, a3）：另取3支比色管分别加0.5%cmc3ml,酶液lml,在水浴 锅中50度保温30min,取出后立即用沸水溶lomin,冷却。加入3口13,5二硝基水杨酸 显色剂，再沸水浴lomin,冷却后再加水定容至25ml,混匀，在550nm处比色二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖含量1、标准曲线的绘制：分别吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.&am

5、p;1.0毫升的葡萄糖于6支试管中（分別记为123.4.5.6）,均用蒸锚水稀释至1毫升，加3,5二硝基水杨酸显色剂3毫升，在沸水浴 中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸锚水定容至25毫升，摇匀。在550nm处比色，以光密 度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘制标准曲线。2、取西瓜汁3ml定容至100ml备用3、取3支比色管,分别加入0.5ml的西瓜汁、0.5ml的水和3ml显色剂,沸水浴中lomin, 冷却后加水定容至25ml,混匀，在550nm处比色。【实验结果】标准曲线v = 0. 0577x0. 0450.040. 0350. 030. 0250.020.0150.010. 005000.

6、 10.20.30.40.50.60.70.8550nm吸光值、纤维索酶活力的测定标号1234l6a0ala2a3550nm吸光值00. 1210. 280. 4340. 5480. 6890. 040. 5150. 5150. 496还原糖浓度 (mg/ml)00. 0080.0160. 0240. 0320. 040. 00230. 02970. 02970. 0286还原糖浓度二(0. 0297+0. 0297+0. 0286) /3=0. 0293mg/ml 酶活力=0. 0293*25*1000/ (10/1000000) /30=2. 44x106二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖

7、含量标号123456789550nm吸光值00. 1210. 280.4340. 5480. 6890. 3380. 3300. 358还原糖浓度 (mg/ml)00. 0080.0160. 0240. 0320. 040. 0200.0190. 021还原糖浓度二(0. 02+0. 019+0. 021) /3=0. 02mg/ml西瓜汁中还原糖浓度二(0. 02*25/0. 5)*100/3=33. 33mg/nil【结果分析】一、纤维素酶活力的测定1、市实验结果町知，纤维索酶水解纤维索，水解产物屮有葡萄糖等还原糖，lg纤维索酶活 力为 2.44x106。2、在本实验中,定要注意控制好时间

8、,严格实验操作。样品管al, a2, a在水浴锅中50 度保温30min后，应取出后立即用沸水溶lomin,使酶失活，这一步一定要保证3个样 品管的反应时间相同。二、3, 5-二硝基水杨酸法测还原糖含量1、西瓜汁中还原糖的浓度为33. 33mg/mlo2、在进行比色时，一定要将溶液混匀再进行测定。【思考讨论】一、纤维索酶活力的测定1、通过本次实验的测定，可以看出纤维素酶可以水解纤维素，牛成衙萄糖等还原糖。2、通过本次实验，还可以得出，纤维素陆的最适ph为4. 5,最适温度为50度。在实际的 应用中，也应该关注影响酶活力的因素，寻找最佳条件，以达到最大催化效率。3、本实验中，直接测纤维索酶的活力有困难，而使用比色法测还原糖浓度较简单，所以我 们通过测定生成的还原糖浓度来间接测纤维素酶的活力，这样操作简单，数值也较准确。 在实验中，当直接测量有难度吋，我们可以考虑通过间接法来测量。二、3, 5-二硝基水杨酸法测述原糖含量1、严格控制1-9