水稻单片段代换系SSSL的构建修回稿

1、 利用高代回交和SSR标记辅助选择构建水稻单片段代换系群体的构建 郭晓琴1，21，王岚1，张桂权2*(1.1.中州大学，河南 郑州 450044；2.华南农业大学植物分子育种广东省重点实验室,广东 广州 510642 ；)摘要：为以优良水稻品种华粳籼74研究水稻QTL的遗传机制，同时对优良水稻品种华粳籼74进行进一步遗传改良，以华粳籼74为受体, 以来源广泛的11个水稻品种为供体, 通过高代回交和微卫星标记辅助选择相结合的方法, 构建了水稻的一个单片段代换系群体。该群体由6059个单片段代换系组成，每个单片段代换系只含有来自一个供体的一个染色体代换片段, 而遗传背景与华粳籼74相同。这些单片段

2、代换系的代换片段分布在除12号染色体之外的其他11条染色体上, 6059个代换片段的长度在0.258.5cM之间，大多数代换片段的长度为030cM。代换片段长度较小的单片段代换系是用于QTL精细定位的优良材料。关键词：水稻；单片段代换系；微卫星标记；分子标记辅助选择Development ofing Sing le Segment Substitution Lines ( SSSLs ) in Rice (Oryza sativa L. ) Using Advanced Backcrosses and SSR MASGUO uo Xiao-qin1,2 1， WANG Lan1Song Hon

3、g-zheng2 ，ZHANG Gui-quan2*（1.1.Zhongzhou University， Zhengzhou 450044，China；2.Guangdong Key Laboratory of Plant Molecular Breeding South China Agricultural University，Guangzhou，510642，China；2.Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）)Abstract: In order to study the genetic mechanisms of

4、rice QTL and improve genetic traits of Huajingxian 74，A a novel population consisted of 60 59 single segment substitution lines ( SSSLs ) was developed with Huajingxian 74 as a recipient and eleven varieties as donors through backcrossing and SSR marker-assisted selection ( MAS ). The substituted se

5、gments in the SSSLs distributed on eleven rice chromosomes except Chr.12. The estimated length of the substituted segments in SSSLs ranged from 0.2 cM to 58.5 cM, and most of the length of the substituted segments concentrate between 0cM and 30cM.Key words: rice, single segment substitution line, mi

6、crosatellite marker; molecular marker-assisted selection水稻重要的农艺性状大多数都是数量性状，分析数量性状的遗传机制对于水稻品种的定向改良具有重要的指导意义。在常规的初级作图群体中，由于遗传背景和数量性状座位(Quantitative Trait Locus, QTL)上位性互作的影响，QTL作图的准确度和灵敏度并不高1。相对而言，利用经过改良的次级作图群体在相似的遗传背景下对数量性状的QTL进行作图，消除了大部分遗传背景的干扰，从而能够提高作图的准确度和灵敏度2。单片段代换系（single segment substitution li

7、nes，SSSL）是采用连续回交和分子标记辅助选择技术相结合建立的近等基因系。在每个单片段代换系的基因组内都只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同，每个SSSL都是受体基因型的一个近等基因系，所有在单片段代换系之间，或与其受体亲本之间的可遗传的变异都与代换片段相联系2-4，因此单片段代换系在控制数量性状基因（QTL）的鉴定与定位、功能研究及克隆方面具有重要的利用价值5-9。目前，水稻上建立的多个代换系群5,110-12，主要是为了定位某个特定基因或鉴定控制某个特定性状的QTL而建立的，一个受体亲本只有一个供体来源，大多数的代换系含有多个片段，有些覆盖率也不高。

8、早年建立代换系主要是利用RFLP标记为选择手段，检测过程复杂、花费大、时间长，不利于进行大规模的快速检测13。微卫星标记技术是在RFLP标记之后发展起来的新一代分子标记技术，是一种以PCR（polymerase chain reaction）为基础的共显性标记，多态性高，操作简单，检测快速，数量丰富13- 17，目前在水稻中已构建了饱和致密的微卫星标记图谱可供利用15-16，为分子标记辅助选择奠定了良好基础。本研究用生产上正在推广的优良水稻品种华粳籼74为受体亲本，以来自于世界各地区的11个水稻品种（系）为供体，利用回交和微卫星标记相结合的方法建立以华粳籼74为遗传背景的单片段代换系群体，旨在

9、为水稻重要农艺性状的鉴定、定位和克隆奠定基础，同时为华粳籼74的进一步遗传改良提供材料。1 材料和与方法1.1 亲本材料本研究选用优良推广品种华粳籼74为受体亲本，选用6个籼稻，5个粳稻共11个水稻品种为供体亲本（见表1）。 表1 供试的亲本材料1）亲本类别品种名称代号原产地类型受体亲本华粳籼74W0中国籼稻供体亲本Amol 3 (Sona)W2伊朗籼稻供体亲本苏御糯W7中国粳稻供体亲本IR64W8IRRI籼稻供体亲本Basmati 370W11巴基斯坦籼稻供体亲本联鉴33W14中国籼稻供体亲本美国茉莉香稻W15美国籼稻供体亲本IRAT 261W18尼日利亚粳稻供体亲本成龙水晶米W20中国籼稻

10、供体亲本KhazarW22伊朗粳稻供体亲本LemontW23美国粳稻供体亲本IAPAR 9W27巴西粳稻1.2 实验方法1.2.1 亲本多态性的检测和微卫星标记检测方法 本实验选用520个微卫星标记对各个供体亲本与华粳籼74之间的多态性进行检测，利用有明显多态性的微卫星标记进行代换片段的检测。微卫星标记引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Tris、EDTA和SDS等购自SIGMA公司，其余试剂是国产分析纯产品。DNA的提取按Zheng等28的简易SDS抽提法进行。PCR扩增按照Panaud 等17（1996）的方法进行。20l反应体系中包括0.15M的引物、200M dNTP、1

11、15;PCR反应缓冲液、50100ng的DNA模板、1UTaq酶。反应在PE9700型热循环仪中进行，所用的反应程序为：94预变性5分钟，循环（94 1分钟、55 1分钟、72 1分钟）35次，最后72延伸5分钟。PCR产物用6聚丙烯酰胺变性胶电泳。电泳完毕后，银染成像后记录结果。1.2.2 水稻单片段代换系的选育与供体残留片段的检测方法 本研究采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法建立染色体单片段代换系18。杂交方法采用离体穗杂交技术1926，杂交和回交都以华粳籼74为母本。水稻种子为实验室前期选育的含有一个杂合片段或两2个杂合片段的BC5F1种子，共计92份。每个材料种植40株，提取10株

12、的叶片DNA进行分子标记检测。所选用的标记为早期世代（BC4F1）检测到的代换片段上的有多态性的SSR标记。每个株系选择10株进行片段检测，选出一批纯合的单片段代换系。1.2.3 遗传背景中供体残留片段的检测方法 本研究将跟踪检测的片段称为目的片段，将遗传背景中供体的其余片段称为残留片段。用亲本间有多态的标记对BC5F2选到的单片段代换系的候选单株进行遗传背景中供体残留片段的检测。随后在BC5F3对筛选到的单片段代换系做第2二次的背景检测，进行进一步的验证。1.2.4代换片段长度的计算方法 参照水稻微卫星标记图谱上标记间的距离16,20，按照按Paterson等217（1991）的方法计算代换

13、片段的长度。如图1.1所示。图1 单片段代换系代换片段长度计算的示意图图中白色区段为受体亲本的遗传背景，黑色区段为已检出的代换片段，阴影区段为重组可能发生的区段。R为受体标记基因型，D为供体标记基因型。LMAX为代换片段的最大长度，LMIN为代换片段的最小长度，L为代换片段的估计长度。R1D2R2D1LMINLLMAX按McCouch和黄朝锋的水稻微卫星标记图谱上标记间的距离计算代换片段的长度16,25。2 结果与分析2.1 供体亲本与华粳籼74之间的多态性对11个供体亲本与受体亲本华粳籼74之间的微卫星标记多态性进行了检测与分析（表2）。在水稻的微卫星遗传图谱上，按照等间距的原则，选用了52

14、0对SSR进行亲本的多态性筛选。表1.2 11个供体亲本与华粳籼74的微卫星标记多态性供体亲本代号标记总数多态标记数多态率/（%）平均多态标记间距/ （cM）1）Amol 3（Sona）W252017934.42 8.52 苏御糯W752029055.77 5.26 IR64W852018635.77 8.20 Basmati 370W1152026150.19 5.84 联鉴33W1452021841.92 7.00 美国茉莉香稻W1552018034.62 8.47 IRAT 261W1852029857.31 5.12 成龙水晶米W2052016030.77 9.53 KhazarW22

15、52029256.15 5.22 LemontW2352027853.46 5.49 IAPAR 9W2752028254.23 5.41 平均52023945.87 6.73 1）按RGP图谱的全基因组的总长度（1528.1cM）/多态标记数来计算由表1.2可知，11个供体亲本的平均多态标记数为239个，其中IRAT 261和Khazar与华粳籼74之间的多态率较高，分别为57.31%和56.15%，而成龙水晶米和Amol 3（Sona）较低，分别为30.77%和34.42%。对照表1.1中的资料可以看出，多态性高的供体均为粳稻，多态性低的供体均为籼稻，而受体华粳籼74为籼稻。说明籼粳稻之间

16、的遗传差异大，标记多态率高；籼稻之间的遗传差异小，标记的多态率低。各供体亲本平均标记距离均在10cM以下，11个供体亲本的平均标记距离为6.73cM，其中最大的为9.53cM，最小的为5.12cM。2.2 遗传背景中供体亲本的残留片段本研究将跟踪检测的片段称为目的片段，将遗传背景中供体的其余片段称为残留片段。分别在BC5F2和BC5F3代进行了2两次背景检测（表3）。表1.3 BC5F2遗传和BC5F3背景代遗传背景中的残留片段 供体亲本亲本代号选用标记数PCR 样品总数残留片段样品数残留片段样品率/%*BC5F2BC5F3BC5F2BC5F3BC5F2BC5F3Amol 3（Sona）W23

17、61801800000苏御糯W736396180401.010IR64W836108108120.931.85Basmati 370W1136324324110.310.31联鉴33W1436144720000美国茉莉香稻W1536180144100.560IRAT 261W1836216144230.932.08成龙水晶米W20361441440000KhazarW2236576252811.390.4LemontW2336360288401.110IAPAR 9W2736792720220.250.28合计396342025562390.670.35* 残留片段样品率等于残留片段PCR样品

18、数除以总的背景检测的PCR样品数。供体亲本代号被测 单株数选用 标记数PCR 样品总数残留片段样品数残留片段样品率（%）*Amol 3（Sona）W253618000.00 苏御糯W7113639641.01 IR64W833610810.93 Basmati 370W1193632410.31 联鉴33W1443614400.00 美国茉莉香稻W1553618010.56 IRAT 261W1863621620.93 成龙水晶米W2043614400.00 KhazarW22163657681.39 LemontW23103636041.11 IAPAR 9W27223679220.25 合

19、计953963420230.67 * 残留片段样品率等于残留片段PCR样品数除以总的背景检测的PCR样品数。第1次残留片段检测是在BC5F2世代进行第一次残留片段检测，（表1.3），选用了36个亲本间有多态性的SSR标记，对95个单片段代换系的候选单株进行了背景检测，共完成3420个PCR样品的检测工作，残留片段上的PCR样品数为23个，残留片段样本率为0.67%。在BC5F3代遗传背景中残留片段的检测结果列于表1.4。选用了36个亲本间有多态性的SSR标记，对71个BC5F3单片段代换系的候选单株进行了背景检测，共完成2556个PCR样品的检测工作，残留片段上的PCR样品数为9个，残留片段样

20、本率为0.35%。表1.4 BC5F3遗传背景中的残留片段供体亲本代号被测 单株数选用 标记数PCR 样品总数残留片段样品数残留片段样品率（%）Amol 3（Sona）W253618000.00 苏御糯W753618000.00 IR64W833610821.85 Basmati 370W1193632410.31 联鉴33W142367200.00 美国茉莉香稻W1543614400.00 IRAT 261W1843614432.08 成龙水晶米W2043614400.00 KhazarW2273625210.40 LemontW2383628800.00 IAPAR 9W272036720

21、20.28 合计71396255690.35 2.3 单片段代换系群体的代换片段2.3.1代换片段的来源和分布经过微卫星标记的检测、选择及严格的遗传背景残留片段的分析后，本实验在BC5F3共选到5960个不重复的单片段代换系（见表1.54）。表4 59个单片段代换系的代换片段15编号代换片段染色体最短长度/cM估计长度/cM最长长度/cMW02-10-7-6-03-2-3PSM174-RM32-RM167-RM409-PSM410-RM202-RM536-PSM412-PSM413-PSM414-PSM415-RM209-RM229-PSM416-RM211154.658.562.4W02-1

22、0-7-6-03-2-4PSM409-PSM410-RM202-RM536-PSM412-PSM413-PSM4141139.346.653.8W02-10-7-6-03-5-10PSM415-RM209-RM229-PSM416-RM21PSM415-RM209-RM229-PSM416-RM21114.67.710.7W02-10-7-6-12-1-2PSM413-PSM415-RM209-RM229-PSMP416-PSM3651110.718.125.4W02-15-1-8-14-5-1RM195- RM556-RM 210- PSM395-RM502-RM447-RM352-RM26

23、4-PSM396839.239.940.5W07-07-4-1-3-3-5PSM139-PSM140-PSM141-PSM436-PSM481-PSM14274.614.123.5W07-07-4-1-6-2-7RM125-RM2-PSM146-RM21470.34.28W07-11-2-1-3-1-2PSM416-RM206-RM254-PSM346-PSM346111017.625.1W07-11-6-4-7-2-5RM49-RM6-RM530203.77.4W07-19-2-1-2-1-3RM218-RM232-RM7-RM251-RM563W08-16-3-4-14

24、6-5-6PSM301-PSM305-PSM304300.40.8W11-06-1-6-4-4-1PSM374-RM183-RM263-RM526-PSM525221.127.834.5W11-06-1-6-4-4-3PSM374-RM183-RM2632010.220.3W11-07-2-1-8-2-2PSM304-RM132-RM569-RM489-RM545317.820.322.8W11-07-2-1-8-5-9RM132-RM569-RM489-RM545-OSR16-PSM429316.825.233.6W11-09-3-9-8-7-1RM275-RM528-RM30-RM4006

25、4.313.923.5W11-18-1-6-09-1-6RM449-RM24-RM091011.523W11-18-1-6-09-1-8RM562-RM449-RM24-RM0914.914.123.3W11-18-1-6-16-2-4R09-RM5-RM488103.16.2W14-01-5-6-2-5-7PSM407-RM228-RM333-RM591-RM5901004.99.8W14-12-3-6-4-4-3RM111-RM253-RM350-RM402-RM50-RM136615.223.431.6W15-02-7-6-1-05-7OSR10-RM286-PSM175-RM332-R

26、M167-RM120112025.330.5W15-02-7-6-1-07-2RM286-PSM175-RM332-RM167-RM120110.515.430.2W15-02-7-6-1-10-4PSM408-OSR0-RM286-PSM175-RM332-RM1671119.820.120.3W15-12-3-2-2-3-5RM589-RM170-RM190-RM587-RM225-RM217W18-18-7-2-1-30-5PSM27-PSM13-PSM12-RM84-RM86-RM220-RM1-RM283-RM272113.718.723.6W22-03-6-1-

27、19-2-6RM136-RM527-PSM388-RM3-RM541-PSM136-PSM162617.52736.5W20-10-4-5-6-1-6RM257-RM288-RM242-RM160-OSR28-RM201-RM215-RM340913.719.425W20-15-1-9-1-4-4短臂末端-PSM156-RM444-RM21993.21220.7W20-20-4-7-3-1-7RM222-RM216-PSM163-RM269108.525.943.3W22-09-2-10-4-9-4PSM158-PSM160-PSM161-RM409-PSM400-PSM337-RM41092

28、2.627.432.1W22-12-5-1-18-3-5RM332-RM167-PSM409-RM120-PSM4101110.212.915.6W22-12-7-4-16-7-4RM131-RM127-RM124-RM280-RM559W22-17-4-3-5-3-5RM470-RM451-RM317403.77.3W22-17-4-9-10-2-6RM218-RM232-RM251-RM282-PSM52311.713.916W23-03-8-8-9-5-2PSM158-PSM159-RM105-PSM161-RM410-RM257-RM228-RM242933.536

29、.339.1W23-07-6-01-04-1-7RM508-RM589-RM190-RM58761.45.29W23-07-6-10-10-3-7RM50-RM539-RM136-PSM388-RM3-RM541-RM162-RM275-PSM431636.546.456.2W23-07-6-10-14-4-1RM217-RM111-RM253-RM50-RM402-RM539615.225.435.5W23-09-4-1-3-1-10RM135-RM504-RM168-RM186-RM55W23-09-4-6-1-1-5RM504-RM504-RM186-RM168-RM

30、55-RM132-RM520-RM293314.816.818.7W27-03-5-1-5-9-1PSM27-RM24-PSM13-RM428-PSM12-RM84-RM86-RM22017.713.218.7W27-03-5-2-4-3-9短臂末端-RM462-PSM27-RM24-PSM13-RM428-PSM12-RM84-RM86-RM220110.717.424W27-04-1-2-1-7-4PSM399-PSM157-PSM158-RM10592.410.919.3W27-04-5-9-2-2-2RM190-RM204-RM225-RM217-RM314-RM111-RM253-R

31、M217W27-05-4-2-3-4-7RM44-RM339-RM515807.414.7W27-05-4-3-4-2-8rm502-RM447-PSM3528035.9W27-05-7-3-4-03-9短臂末端-RM508-RM589-RM21764.610.115.5W27-05-7-3-4-10-4RM508-RM589-RM190-RM204-RM225-RM21767.510.814.1W27-05-7-5-5-08-9RM164-RM440-RM161-PSM384-RM188-RM421-RM2652328.934.8W27-05-7-5-5-09-7PSM3

32、84-RM188-RM421-RM26-RM274-RM31515.921.426.9W27-05-7-5-5-10-3RM274-RM31-RM334-PSM385-PSM12352.57.612.6W27-08-7-1-2-2-3RM451-RM317-RM127-RM303-PSM110-PSM107-PSM382-RM127-RM124-RM280-长臂末端435.235.335.3W27-08-7-1-2-2-7PSM382-RM127-RM124-RM280-长臂末端W27-14-1-2-7-3-1OSR23-RM529-PSM369-PSM370-PSM371

33、-长臂末端120.321.622.8W27-14-1-2-7-3-2PSM423-OSR23-RM529-PSM369-PSM370-PSM371-长臂末端122.826.830.8W27-18-1-2-10-2-3PSM429-RM7-RM563306.212.4W27-18-2-3-7-4-6PSM136-RM162-RM275606.913.7W27-18-5-5-12-4-3RM467-RM271-RM30410013.827.56059个不同的代换片段分别来自于11个供体，其中来自供体IAPAR 9的代换片段最多，有18个，而来自其他它供体亲本的均在10个以下。除12号染色体外，60

34、59个代换片段分布在其余11条染色体上，但是在各条染色体的分布不均匀，其中，6号染色体上最多，共有11个；7、2、8号染色体上最少，分别只有2、3、3个（表1.56）。表1.56 代换片段在各供体及12条染色体上的分布供体亲本代号染色体1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 合计Amol 3（Sona）W2 1 4 5 苏御糯W71 1 2 1 5 IR64W81 1 Basmati 370W113 2 2 1 8 联鉴33W141 1 2 美国茉莉香稻W151 3 4 IRAT 261W181 1 成龙水晶米W202 1 3 KhazarW22 1 2 1 1 1 6 Lemo

35、ntW232 3 1 1 7 IAPAR 9W274 1 2 3 4 2 1 1 18 合计8 3 8 4 3 11 2 3 5 4 9 60 2.3.2 代换片段的长度各个单片段代换系的代换片段的长度差别较大（表1.5），60个不同的代换片段的长度分布如图1.2所示。6059个代换片段的长度分布在0.258.5cM之间，绝大多数代换片段的长度集中在030cM。代换片段长度较小的单片段代换系是用于QTL精细定位的优良材料。图1.2 SSSL中代换片段长度的分布5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60代换片段的长度（cM）单片段代换系数3. 讨论本试实验以来源广泛的1

36、1个水稻品种为供体，一个生产上正在推广的优良品种为受体，通过杂交、回交和MAS相结合的方法构建选育水稻的单片段代换系群体，有别于传统的构建次级作图群体时往往是用一个供体和一个受体的方法。因为不同供体往往具有各自不同的特征特性，多个供体可以提供较多的有利基因，所构建的单片段代换系群体可以包含水稻栽培种内较多的基因资源，从而为水稻功能基因的全方位鉴定和利用奠定基础。本研究以SSR标记为工具构建单片段代换系群体，和以往的利用RFLP标记构建次级作图群体相比，实验程序更简单、更快捷23-24。和其它次级作图群体相比，单片段代换系内的供体染色体片段数最少，背景中全为受体的基因组成分，遗传背景更纯净，因此

37、，单片段代换系在遗传育种上有更高利用价值和更广泛的使用范围。水稻育种中的基因资源大都分散在各种类型的水稻品种中，建立单片段代换系是鉴定新基因（QTL）的有效途径3,829-930。由于单片段代换系中供体染色体片段的单一性，使单片段代换系与受体亲本遗传组成上的唯一区别仅局限在目标染色体片段内，这一特性使新基因或QTL的发现与鉴定变得的非常简单；单片段代换系内供体染色体片段的单一性，消除了遗传背景及QTL之间互作的干扰，保证了QTL定位的准确性7,29,31-32。此外，与和传统的基因效应分析方法相比，单片段代换系更利于进行基因效应分析22-24。加性和显性效应的计算，只需要比较单片段代换系的纯合

38、体、杂合体及受体三者在某一数量性状上表型的差异；上位性效应的分析，只要把2个纯合的单片段代换系杂交，调查不同标记基因型间目标性状的表现型的差异。单片段代换系遗传上的稳定性，使其可以同时被种植在几个环境中，用于研究特殊QTL与环境的互作效应，也从而使鉴定准确、可靠还可以把单片段代换系与不同的测验种杂交，用于研究QTL与遗传背景的互作2-4,30 利用单片段代换系进行QTL定位的一个前提是尽可能地排除掉影响目标性状的其他它片段。因此，在建立染色体单片段代换系后进行遗传背景残留片段的检测非常重要。为了防止小的供体片段的漏检，有必要利用饱和的分子标记连锁图，以鉴定出更可能多的供体片段。本试验加强了遗传

39、背景残留片段的检测，在BC5F2和BC5F3进行了残留片段的检测，并将检出有残留片段的单株全部淘汰掉，保证了建立的单片段代换系的准确可靠性。由大量的单片段代换系组成的单片段代换系文库可以作为一个高水平的育种材料平台，利用单片段代换系文库内带有不同性状的单片段代换系进行聚合育种，可以迅速把不同优良基因聚合到一起，育成符合人们需要的品种。另外，本试实验选用的11个供体亲本来源广泛，而且每个亲本都有个别突出的优良性状，将这些优良性状导入华粳籼74也是对其改良的一种途径。参考文献:1.Jeuken M J W, Linshout P. 2003. Future perspective of backc

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