发酵工程发酵工业菌种

1、1会计学发酵工程发酵工业菌种发酵工程发酵工业菌种四、发酵工业菌种保藏四、发酵工业菌种保藏第1页/共130页第一节第一节 常用发酵工业菌种常用发酵工业菌种第2页/共130页菌种选育有何意菌种选育有何意义？义？第3页/共130页n菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。第4页/共130页第5页/共130页第6页/共130页第7页/共130页工业发酵微生物可培养微生物未培养微生物少数少数大多数大多数缺乏敏感检测技术缺乏敏感检测技术培养基中营养过剩培养基中营养过剩微生物间相互作用微生物间相互作用认识不足无法原位培养认识不足无法原位培养细菌放线菌酵母菌霉菌第8页/共130页主要用

2、于生产酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等。第9页/共130页nn大肠杆菌大肠杆菌可生产天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸以及谷氨酸脱羧酶、天冬酰酶等。第10页/共130页第11页/共130页主要用于生产多种抗生素多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。第12页/共130页主要用于生产食用、药用和饲料用蛋白等。第13页/共130页的代谢进行啤酒、白酒、黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及生产乙醇、甘油、有机酸及麦角固醇等多种产品。第14页/共130页主要用于生产酶制剂、有机酸、抗生素及甾体激素等。第15页/共130页第16页/共130页第17页/共130页研研究方法究方法1、模拟自然培养法、

3、模拟自然培养法：原位培养、培养条原位培养、培养条件优化、单细胞操作。件优化、单细胞操作。2、宏基因组分析法：测序分析未培养微、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，结合蛋白质组学，了解其生物的基因组，结合蛋白质组学，了解其代谢途径、基因表达调控机制等。代谢途径、基因表达调控机制等。第18页/共130页第二节 发酵工业菌种的分离筛选第19页/共130页第20页/共130页第21页/共130页第22页/共130页从自然界筛选菌种从自然界筛选菌种第23页/共130页新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤第24页/共130页第25页/共130页细菌、放线菌（有机质丰富、阴暗潮湿）霉菌、酵母菌

4、微生物少第26页/共130页第27页/共130页第28页/共130页第29页/共130页第30页/共130页第31页/共130页第32页/共130页第33页/共130页第34页/共130页 划线分离法划线分离法平板划线平板划线法法第35页/共130页稀释分稀释分离法离法 稀释倒稀释倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。板。第36页/共130页样品充分混匀；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度只能接触一个稀释度的菌液；的菌液；同一稀释度三个以上同一稀释度三个以上重复重复,取平均值；取平均值；

5、每个平板上的菌落数每个平板上的菌落数目合适，便于准确计目合适，便于准确计数；数；第37页/共130页第38页/共130页变色圈法 ; 透明圈法 ; 生长圈法 ; 抑菌圈法 .第39页/共130页菌时，若平板上出现产酸菌，其菌落周围就变成黄色，可从黄色圈中挑取菌落。第40页/共130页取所需菌落。第41页/共130页板培养基上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。第42页/共130页第43页/共130页液进行目的产物检测或进行菌种活性测定，通过比较可以初步筛选出少量生产能力较高的菌株。第44页/共130页现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。第45页/共130页第46页/共

6、130页条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验，以便初步掌握野生型菌株适合的培养条件，为育种提供依据。第47页/共130页第48页/共130页第49页/共130页筛选模型：形态筛选模型：形态依据依据第50页/共130页测定测定第51页/共130页第三节 发酵工业菌种的鉴定第52页/共130页第53页/共130页经典的鉴定指标经典的鉴定指标第54页/共130页第四节 发酵工业菌种的改良第55页/共130页高产的新产品高产的新产品第56页/共130页第57页/共130页第58页/共130页第59页/共130页第60页/共130页仅影响一对碱基影响一段染色体第61页/共130页1. 出发菌株的选择出

7、发菌株的选择2. 菌悬液的制备菌悬液的制备3. 前培养前培养4. 诱变诱变5. 变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选第62页/共130页2021-12-464第63页/共130页第64页/共130页 常用诱变剂及其类常用诱变剂及其类别别物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂碱基类似物 与碱基反应的物质在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质紫外线快中子X射线射线激光2-氨基嘌呤5-溴尿嘧啶8-氮鸟嘌呤8-AG硫酸二乙酯（DES）甲基磺酸乙酯（EMS）亚硝基胍（NTG）亚硝基甲基脲（NMU）亚硝基乙基脲（NEU）亚硝酸（NA）氮芥（NM）4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）乙烯亚胺（EI）羟胺吖啶类

8、物质ICR类物质噬菌体ICR是美国肿瘤研究所（The Institute for Cancer Research）的缩写，ICR化合物是该研究所合成的吖啶类的氮芥衍生物。第65页/共130页合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量通常采用低剂量、长时间处理。第66页/共130页 凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。第67页/共130页两条重要的实验曲两条重要的实验曲线线横坐横坐标标纵坐标纵坐标 剂量存活率剂量存活率曲线曲线诱变剂诱变剂的剂量的剂量细胞存活数细胞存活数的的对数值对数值 剂量诱变剂量诱变率曲线率曲线诱变剂诱变剂的

9、剂量的剂量诱变后获得诱变后获得的的突变细胞数突变细胞数第68页/共130页如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高。菌落的棕红色变深者往往产量有所提高。第69页/共130页第70页/共130页类型类型示例示例活性离子N+、C+、O+、H+、P+惰性离子Ar+、Ne+金属离子Fe+、Zn2+第71页/共130页和提高工业产量。和提高工业产量。第72页/共130页第73页/共130页第74页/共130页第75页/共130页第76页/共130页在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈（用碘液

10、使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。第77页/共130页第78页/共130页第79页/共130页第80页/共130页第81页/共130页第82页/共130页第83页/共130页第84页/共130页选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的

11、细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青青霉素霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤原生质体融合的主要步骤是：是：第85页/共130页第86页/共130页化器中连续培养。n循环培养：在含诱导物和不含诱导物的培养基上交替培养。第87页/共130页中间代谢产物积累。4、抗反馈调节突变株的选育：解除合成代谢反馈调节机制，终产物不断积累。抗反馈突变型和抗阻遏突变型。第88页/共130

12、页应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节应用营养缺陷型菌株解除正常的反馈调节 天冬氨酸天冬氨酸 磷酸天冬氨酸 半醛高丝氨酸 苏氨 酸 甲硫 氨酸 C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产赖氨酸为反馈抑制为阻遏AKHSDH第89页/共130页第90页/共130页大的创造具有工业应用大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。价值的生产菌株的潜力。第91页/共130页和鉴定和鉴定外源基因的表外源基因的表达达第92页/共130页第93页/共130页第94页/共130页的体外定向进化（随机化突变、定向筛选）第95页/共130页n改变蛋白质的一级结构n普遍用于菌种改良第96页/共130页第97页/共1

13、30页第98页/共130页代谢末端产物的产量。代谢末端产物的产量。（3 3）构建代谢旁路）构建代谢旁路（4 4）改变能量代谢途径）改变能量代谢途径第99页/共130页第100页/共130页基因将原来细胞中无关的两基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。成新的代谢途径。第101页/共130页第102页/共130页nn关键：确定希望表型的遗传基础。第103页/共130页第四节 发酵工业菌种保藏第104页/共130页工业生产菌种的退化现象及原因工业生产菌种的退化现象及原因 菌种退化（degeneration）主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的优良菌株

14、，由于连续传代或保藏之后，群体中某些生理和形态特征逐渐退化或完全丧失（包括菌株产孢子能力、发酵主产物产量下降）的现象。第105页/共130页1、退化的表现菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体变得小而少；生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的橘红色分生孢子层；第106页/共130页抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱。代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素能力下降；第107页/共130页2）连续传代第108页/共130页1）从菌种选育方面考虑在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理；在使单链突变的

15、同时，使另一条单链丧失模板作用，以减少出现分离回复现象；诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌株的“纯度”。第109页/共130页2）控制传代次数 如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌株，回复子的比例随传代次数的增加而增加，腺苷产量也随之下降。 3）创造良好的培养条件在进行栖土曲霉培养时，温度从28-30提高到33-34，可防止产孢子能力的衰退。第110页/共130页5）采用有效的菌种保藏方法 第111页/共130页1、纯种分离法 在衰退菌种的细胞群中，一般还存在仍保持原有性状的个体，设法对其进行分离纯化。2、淘汰已衰退的个体 采用高温或低温及其方法淘汰衰退的个体。 第112页/共1

16、30页3、选择合适的培养条件 如平菇菌种在PDA培养基上连续传代会导致菌种衰退，而在PDA综合培养基（PDA中添加维生素和蛋白胨等）中培养则能使衰退的菌种复壮。第113页/共130页v菌种保藏的基本原理： 根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过降低培养营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。第114页/共130页1斜面保藏法 这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌和放线菌都可应用。 3沙土管干燥保藏法： 这种方法适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附

17、在各种载体上，干燥后保藏。第115页/共130页第116页/共130页6低温保藏法：大多数微生物可在-20以下的低温中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入12mL的菌液，直接放入低温冰箱中保藏。 第117页/共130页第118页/共130页6）兽医微生物菌种保藏管理中心农业部兽医药品监察所第119页/共130页第120页/共130页5）日本东京科研化学有限公司KCC6）英国国立标准菌种收藏所NCTC7）美国国立卫生研究所NIH8）美国农业部北方开发利用研究部NRRL 第121页/共130页第122页/共130页工业发酵微生物可培养微生物未培养微生物少数少数大多数大多数缺乏敏感检测技术缺乏敏感

18、检测技术培养基中营养过剩培养基中营养过剩微生物间相互作用微生物间相互作用认识不足无法原位培养认识不足无法原位培养细菌放线菌酵母菌霉菌第123页/共130页第124页/共130页第125页/共130页类型类型示例示例活性离子N+、C+、O+、H+、P+惰性离子Ar+、Ne+金属离子Fe+、Zn2+第126页/共130页选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青青霉素霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤原生质体融合的主要步骤是：是：第127页/共130