生化课程论文——萌发小麦种子淀粉酶学的测定

1、生物化学论文萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究学院：生命科学学院学号：A09110038班级：生科1101班姓名：冯旭萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究冯 旭收稿日期：2012128基金项目：无作者简介： 冯旭（1993-），男，本科生，生物科学专业。E-mail: baoquanshangjiang， 张仲文2（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）摘 要：测定萌发小麦种子中淀粉酶的活性并对淀粉酶的活性影响因素进行讨论，对淀粉酶活性的测定是通过测定淀粉酶分解淀粉所得产物麦芽糖的量来表示酶的活性。麦芽糖能将3、5二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅

2、与麦芽糖浓度成正比，利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值，从而得到产物麦芽糖的量，来表示酶的活力1。定性分析了温度，PH值及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响（利用分解剩余的淀粉和碘液呈蓝色的程度来进行比较）。由此得到最适宜的温度和PH值，以及抑制剂和激活剂的种类。关键词：淀粉酶、温度、PH、抑制剂、激活剂、分光光度计The research of amylase from sprouting wheat seedFeng Xu1 , Zhang Zhongwen2 (College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Ha

3、rbin 150030, China) Abstract: Determine the amylase activity from sprouting wheat seed and discus the reason that have influenced the activity of amylase. The way to determine the amylase is by determines the content of Malt sugar from starch. Malt sugar cans reduction 3, 5 two salicylic acid to azy

4、l_compound (have the maximum absorption on 520nm), the color will be deep when it has much Malt sugar. We can determine the amylase activity by this way. We always analyses the effect of temperature, PH, activator and restrainer to the activity of amylase, then draw a conclusion what temperature, PH

5、, activator and restrainer is the best to amylase. Key word: Amylase; temperature; PH; activator; restrainer; spectrophotometer 本实验以萌发的小麦种子为材料，提取得到了淀粉酶，利用淀粉酶和淀粉酶的活性对温度的差异，分离出淀粉酶，并测定了淀粉酶的活性和淀粉酶和淀粉酶的总活性，计算出淀粉酶的活性，然后对淀粉酶活性影响因素进行了讨论。不同温度、PH条件下和抑制剂激活剂情况下淀粉酶对淀粉水解的程度不同，通过定性的分析温度、PH值和抑制剂激活剂对淀粉酶活性的影响。由此得到酶活性

6、的最适宜的温度和PH值，以及抑制剂和激活剂的种类。1 实验材料与方法11材料 小麦（Triticum aestivum L.）、电子天平、研钵、容量瓶、量筒、刻度试管、试管、移液管、离心机、离心管、恒温水浴锅（40度、100度）、分光光度计、1淀粉溶液、0.4mol/L NaOH、pH=3.0、5.6、8.0的柠檬酸缓冲液2实验方法21麦芽糖标准曲线的制作 211实验原理：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中有淀粉酶及淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。淀粉酶和淀粉酶都各有其一定的特性，如淀粉酶不耐热，在高温下容

7、易钝化，而淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70维持15分钟以钝化淀粉酶，便可测定淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0加以处理，钝化淀粉酶，以测出淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽谈到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。212操作步骤：称取化学纯麦芽糖0、05g溶于少量蒸馏水中仔细移入50

8、mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。取25mL的刻度试管6个，编号1,2,3,4,5,6，分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL，然后依次分别按编号加入蒸馏水2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2，再在各个试管中加3，5-二硝基水杨酸各2.0mL，混合沸水浴反应5min后用蒸馏水定容至25mL，以第一样为空白试剂在540nm的波长下进行比色，并记录消光值。，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（表2-1）表2-1麦芽糖含量实验及吸光值项目123456麦芽糖溶液（mL）0.00.20.61.01.41.8

9、蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60.2DNS试剂（mL）2.02.02.02.02.02.0反应混合后沸水浴反应5min定容用蒸馏水将反应后的溶液定容至25mL比色以1试管为空白对照测540nm时的消光值表2-2原始数据 项目123456吸光值0000700440085010901822.1.3麦芽糖标准曲线:22淀粉酶活性的测定221实验原理：-淀粉酶耐高温（70）不耐酸，-淀粉酶耐酸但不耐高温；温度对酶活性的影响很大，因其本质为蛋白质，因此，在不同的温度下酶的活性因而不同。淀粉酶可使淀粉水解，则当被不同温度处理后，让最后的溶液与KI溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，故加入碘液后根据显

10、色可推知大体上淀粉含量的多少，从而得出不同温度对酶活性的影响程度，并在此之下得出其最适温度。淀粉酶的活性受pH影响显著，淀粉酶在一定pH值范围内才表现它的活性，当被不同pH处理后，让溶液与KI溶液反应，碘液可使淀粉变蓝，从而得出不同pH对酶活性的影响程度，并在此之下得出其最适pH。222操作步骤2221-淀粉酶活性的测定称取萌发的小麦种子2g，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入50mL刻度试管中定容，振荡，放置15分钟后4000r/min离心，取上清液备用。取三支试管，编号注明1为对照管，2、3支为测试管。于每管中各加入酶提取液1mL，在70恒温水浴中，准确加热5分钟，取出后迅速在自来水中冷却

11、。在试管中各加入1mLpH=5.6的柠檬酸缓冲液。向对照管中加入4mL0.4mol/LnaOH， 40恒温水浴中保温15分钟，再加入40下预热的1淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40水浴中准确保温5min取出，迅速加入4mL0.4mol/LnaOH，然后准备下一步糖的测定。  取上述酶提取液2mL，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至50mL，混合均匀后，按淀粉酶测定法操作，（省略70度水浴）（如表2-2，2-3）表（2-2） 酶反应体系和程度管号AA1A2淀粉酶提取液（mL）1.01.01.0加热70水浴15min后冷却至室温（20）柠檬酸缓冲液（mL）各1mL0.4mol/LNaOH（m

12、L）4.00.00.0保温40水浴15min预热的淀粉酶溶液各2 mL酶促反应摇匀后，40水浴15min0.4mol/LNaOH（mL）0.04.04.0经表2-2的处理后，让各个样液与3，5-二硝基水杨酸作用，并测器消光值。详尽步骤如下：（表2-3）麦芽糖样品的测定操作管号0淀粉酶反应液（mL）0.02.02.02.0DNS试剂（mL）2.02.02.02.0蒸馏水（mL）2.00.00.00.0反应各管混匀沸水浴5min定容冷却，用蒸馏水定容至25mL比色以0管为空白对比测540nm处的消光值223结果计算 淀粉酶活性=（A-A）×样品稀释总体积 样品重*CA:淀粉酶水

13、解淀粉生成的麦芽糖量A1:淀粉酶对照管中麦芽糖量C比色所用样品的毫升数-淀粉酶含量：24.5 mg/FW(g)5min-淀粉酶含量：547.6 mg/FW(g)5min总淀粉酶含量：572.1 mg/FW(g)5min23淀粉酶酶学性质研究231粗酶的提取 称取1克萌发的小麦种子研磨成匀浆，倒入25ml具塞刻度的试管中，用蒸馏水稀释至刻度线处，离心（5000r/min）10分钟，取上清液备用。232定性法分析温度对酶活性影响 准备8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d，分别在A、B、C、D管中加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸1ml，淀粉溶液2.5ml;在a、b、c、d管中加入淀粉酶提取液

14、1ml，分别把A、a管放在4冷冻箱中,把B、b管放在室温下,把C、c管放在40水浴中,把D、d管放在沸水浴中,10min钟后把A管中的溶液倒入a管, 把B管中的溶液倒入b管, 把C管中的溶液倒入c管, 把D管中的溶液倒入d管,再把a管放在4冷冻箱中,把b管放在室温下,把c管放在40水浴中,把d管放在沸水浴中,进行酶促反应10min;最后在a、b、c、d管中加入碘液各3滴,并观察颜色变化情况。(表2-4)（表2-4） 温度对酶活性的影响管号AaBbCcDd缓冲液（pH5.6）（mL）1.01.01.01.0淀粉溶液（mL）2.52.52.52.5淀粉酶提取液（mL）1.01.01.01.0预保温

15、（10min）4Aa4室温Bb室温40Cc40沸水浴Dd沸水浴混合酶促反应KI溶液各三滴（滴管先冷却至室温）显色蓝色淡紫淡黄淡蓝23.3定性法分析PH值对酶活性影响 准备三支试管分别编号、,在、管中分别加入PH=3.0、PH=5.6、PH=8.0的缓冲液柠檬酸2ml,淀粉溶液2.5ml,淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。表2-5（表五） pH对淀粉酶活性的影响操作管号缓冲液（pH5.6）（mL）2.0/（pH3.0）2.0/（pH5.6）2.0/（pH8.0）淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶

16、促反应摇匀，40水浴10min碘液各三滴显色蓝色无色蓝色2.3.4定性法分析激活剂或抑制剂对酶活性影响 准备4支试管分别编号1、2、3、4, 第一步在1、2、3、4管中分别加入PH=5.6的缓冲液柠檬酸2ml;在1管中加入NaCl溶液1ml，在2管中加入CuSO4溶液1ml，在3中加入NaSO41ml，在4管中加入蒸馏水1ml，分别中加入0.1%的淀粉溶液2.5ml;分别在4只管中加入淀粉酶提取液1ml;最后各管混匀，放在40水浴中进行酶促反应10min,各加入碘液3滴，并观察颜色变化情况。（表2-6）（表2-6）激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响管号12344缓冲液（mL）各2.0mLNacl

17、溶液（mL）1.0CuSO4溶液（mL）1.0NaSO4溶液（mL）1.0蒸馏水1.0淀粉溶液（mL）各2.5mL淀粉酶提取液（mL）各1.0mL酶促反应摇匀，40水浴10min碘液各3滴显色透明淡蓝兰较浑较透明235 结果 浅蓝色 几乎无色 无色 深蓝色2351温度对小麦淀粉酶的影响a.4：酶的活性几乎完全被抑制，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；b.室温：酶的活性受到一定的抑制，淀粉被部分水解，加入碘液后呈浅蓝色；c.40：酶的活性达到相对最大，淀粉完全被水解，加入碘液后接近无色；d.沸水浴：酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈蓝色；由此可以看出40是小麦淀粉酶的最适温度。浅蓝色 无色 淡

18、蓝紫色2352 PH对小麦淀粉酶的影响a.PH=3.0：淀粉酶完全失活，淀粉未被水解，加入碘液后呈深蓝色b.PH=5.6：淀粉酶活性达到相对最大，淀粉被完全水解，加入碘液后呈无色c.PH=8.0：酶活性受抑制，淀粉被少量水解，加入碘液后呈浅蓝色由此可以看出pH=5.6是小麦淀粉酶的最适PH澄清 蓝色 稍浑浊 澄清稍浑浊2353激活剂，抑制剂对小麦淀粉酶的影响a.空白对照组：加入碘液后几乎呈无色b.加NaCl的溶液：淀粉酶活性增加，使淀粉完全水解，加入碘液后呈无色c.加CuSO4的溶液：淀粉酶活性降低，淀粉被部分水解，加入碘液后呈深蓝色由此可以看出NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉

19、酶的抑制剂3讨论31通过对淀粉酶活性初步研究,说明温度、PH、激活剂、抑制剂是影响淀粉酶活性的重要因素。在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱;在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，直到失去活性；Cl-使酶的活性增强Cu2+使酶活性减弱3。32研究酶有重要的意义。生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一,催化各种生化反应,是生物催化剂;其二,调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性;另一种是通过影响酶分子的合成和降解,以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节4。现代酶