鸡球虫DNA疫苗研究进展

1、鸡球虫dna疫苗研究进展摘要：鸡球虫病是严重危害养禽业的-种寄生虫病。一直以來,鸡球虫病主要依靠药物來进 行防制。但是，随着球虫抗药性问题的日益严重、抗球虫新约开发困难及人们对食品安全的 关注，药物在球虫病控制屮的作用越来越受到限制，因而人们期望用更好的手段来控制鸡球 虫病。dna疫苗是近年发展起來的-种新型疫苗，因其安全、稳定、高效和易于制备而得到 广泛研究。随着鸡球虫保护性抗原基因的不断发现，以及对细胞因子等免疫佐剂在抗球虫感 染中的作川不断深入探索，鸡球虫dna疫苗的研究引起人们的广泛关注和极大兴趣。木文就 鸡球虫d讥疫苗作丿ij机理、抗原基因、载休、免疫佐剂、免疫途径、免疫剂量、免疫程

2、序及 dna疫苗研究进展方面展开一系列论述。关键词：dna疫苗；球虫；鸡鸡球虫病(coccidiosis )是由艾美尔属(eimeria)的球虫引起的 寄生原虫病。全世界报道的鸡球虫有9种，但为世界所公认的有7种: 柔嫩艾美尔球虫(e. tenella)、巨型艾美尔球虫(e. maxima)、 堆型艾美尔球虫(e. acervulina)、毒害艾美尔球虫(e. necatrix)、和缓艾美尔球虫(e. mitis)、早熟艾美尔球虫(e. praecox)、布氏艾美尔球虫(e. brunetti)。以e tenella、e. maxi ma > e accrvulina> e nec

3、atrix、 e brunetti 最为'常见,x'j' 鸡的致病力也较强。雏鸡感染球虫后，大量肠上皮细胞受损、出血， 严重者造成死亡。集约化养鸡场是球虫暴发的主要场所，其发病率高 达50%70%,死亡率为20%30%,严重时死亡率高达80%,对养 鸡业的危害严重。病愈的雏鸡，生长发育受阻，长期不能康复；成年 鸡多为带虫者，其增重和产蛋受到一定的影响，给农业生产带来巨大 损失。据统计，全世界养鸡业因球虫病造成的损失大约为30亿美元。 目前防治球虫病的手段主要依赖于药物，据报道从2000年起，仅英 国每年抗球虫纟勺物的使用就超过230 to由于任何一种抗球虫药物在 使用一

4、段时间后都会出现球虫抗药性问题，这给鸡球虫病的防治带来 很人困难。尽管交替使用不同的抗球虫药物能改善抗药性，但这种改 善并不能持久。球虫药物耐药性的产生、研制新药费用之高以及人们 对药物残留的日益关注和环境保护意识的增强，迫切期望找到更好的 鸡球虫防治手段。传统的强毒苗、弱毒苗预防鸡球虫病因存在安全性 差，免疫效果不理想等因素而得不到广泛应用；球虫基因工程疫苗是 较为理想的疫苗，但免疫保护效果较差。dna疫苗是近年发展起来的 一项新的生物技术，它是将编码抗原蛋口的外源基因d7a克隆到真核 质粒表达载体上，然后将重组质粒dna直接注射到动物体内，使外源 基因通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，激

5、活机体的免疫系统， 进而引发免疫反应。1 dna疫苗免疫的作用机理1990年，wolff等 将dna重组表达载体注入小鼠的骨骼肌中，结果意外发现载体上的基 因在局部肌细胞内表达，且产生了抗体，这偶然发现导致dna疫苗 的诞生。随后，dna疫苗的研究得到了飞速发展。耳前，dna疫苗在 宿主体内诱导的免疫机制虽不十分清楚，但研究表明，dna质粒被导 入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成 抗原，再经过加工、处理、修饰递呈给免疫系统，可以引发全面的免 疫应答反应。dna疫苗接种机体后，质粒被周围的组织细胞（如肌细 胞）、抗原递呈细胞（apc）或其他炎性细胞摄取，被吸收的质粒在

6、机体启动子作用下合成mrna,并被细胞质中的酶复合物-蛋白酶体所 降解，形成氨基酸肽段，然后经抗原转运蛋白（tap）转运至内质网 腔进一步修饰成氨基酸短肽。这些短肽（抗原表位）片段在内质网腔 与新合成的miic- i分子的抗原结合槽和结合，形成抗原肽-miic- i分 子复合物，并转运至细胞表而作为免疫原信号肽供cd84-ctl所识别， 导致其活化、增值并分化为具有杀伤能力的效应ctl (to),诱导产 生较强的细胞免疫反应。另一部分蛋白抗原从分泌它们的抗原递呈细 胞(apc)的细胞膜上进入mhc-ii类型途径，dna疫苗基因表达的抗 原蛋白未经加工被释放出去由专职的apc摄取后，在细胞内经过

7、吞噬 体和溶酶体作用后被降解成具有抗原特异性的多肽，这些多肽同细胞 内质网产工的mhc- ii分了相结合并转运到细胞膜上，被辅助性t细胞 cd4+ th细胞的受体识别。th细胞分泌淋巴因子，刺激b细胞转化 为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异型的体液免疫应答。2影响鸡球虫dna疫苗免疫效果的因素2. 1制备鸡球虫dna疫苗的抗原基因随着分了生物学和免疫学的发展，近年來，研究人员用不同的方法鉴 定出了一些球虫抗原基因，比如通过建立表达性dna文库或cdna艾 库，用抗体筛选球虫抗原基因；或者用抗球虫不同阶段的多克隆抗体 筛选球虫抗原基因；还有些研究者通过建立球虫dna文库或cdna文 库后，用标记

8、的特异性寡聚核昔酸作探针，或用标记球虫本身的rna、 cdna或dna作探针來筛选球虫抗原基因，这些t作为研制可提供保 护力的球虫dna疫苗打下基础。研究显示，鸡球虫在子抱子和裂殖生 殖阶段具有良好的免疫原性，对诱导机体产生保护性免疫应答至关重 要。目前克隆出来的子砲子和裂殖生殖阶段良好的免疫保护性抗原基 因有表面抗原基因ta4、na4、3-ie、mz5-7、ldh、5401、csz-1,细 胞器抗原基因折光体蛋口基因s07和etla基因、微线蛋口基因etmic-1、etmic-2、etmic3、etmic-4、etmic-5 和emtfp250、以及 q-微管蛋白基因l8-10 o这些基因编

9、码的抗原蛋白都具有良好的 免疫原性，为鸡球虫dna疫苗的研究奠定了重耍的基础。2. 2载体dna疫苗载体质粒作为编码抗原目的基因表达抗原的工具，其组成与 结构特征对dna疫苗免疫原性有显著影响。用作dna疫苗的载体必须 具备以下特点：在机体细胞内能高水平地表达目的基因；本身不复 制；不会整合到宿主染色体中。dna疫苗研究中常用的质粒载体包括 真核表达载体如psv2、prsv、pcdna31、pci和pvaxl等。pvaxl载 体来源于pcdna3. 1载体，经过改造专门为开发dna疫苗所设计，符 合美国fda于1996年12月22日公布的关于用于预防感染性疾病 dna疫苗指导规范的有关要求，是

10、目前认为较为安全的疫苗载体。2. 3免疫佐剂2. 3. 1细胞因子近年来，关于细胞因子研究的报道比较多，并发现细胞因子在抗球虫 感染中发挥着重要的作用。细胞因子有多种，国内外在球虫dna疫苗 应用研究比较多的是口细胞介素-2 ( il-2)和干扰素-y ( ifn- y)o il-2是细胞免疫中主要的细胞因子，lithl细胞产生及部分b 细胞产生，可对多种有丝分裂原或抗原包括寄生于细胞内的艾美尔球 虫或子抱子等产生反应。il-2可诱导t和b细胞增值分化，促进细 胞毒性t细胞的前提细胞分化为细胞毒性t细胞，并增强其杀伤效 应，并可促进nk细胞功能及释放干扰素。因为细胞免疫在球虫免疫 中占有十分重

11、要的地位，许多学者对鸡il-2在鸡球虫病中的作用进 行了 研究。我国学者李祥瑞首次在哺乳动物细胞表达克隆系统屮克隆出鸡 tl-2 cdna后,开创了鸡il-2的应用研究。l订lehoj等报道，在 e. tenella或eacervulina感染鸡的前1 d或感染后的1 d,用cona 刺激鸡淋巴细胞产生的细胞因子il-2处理鸡，可以明显降低球虫感 染鸡卵囊的排出量，从而证实了 il-2在抗etenella和e acervulina感染中发挥作用。李宏梅等研究了鸡重组11>-2对球虫感 染雏鸡细胞免疫的影响，用真核细胞表达的重组鸡il-2处理接种球 虫的鸡，淋巴细胞转化试验表明，与感染对照

12、组相比，重组鸡il-2处 理过的鸡脾脏和盲肠扁桃体淋巴细胞转化率显著增高，说明重组鸡 il-2可以消除球虫感染引起的免疫抑制。谢昆等研究了重组鸡il-2 蛋白的抗球虫作用，分别肌肉注射14日龄和21日龄鸡重组il-2蛋 口，1周后感染球虫卵囊，测定抗球虫指数。结果表明，重组鸡il-2 蛋白能减低相对卵囊产量、减少盲肠病变、提高相对增重。choi等 用eacervulina感染鸡，测定脾脏和十二指肠!l-2mrna转录水平, 结果发现，在初次感染和再次感染后，试验组il-2 mrna水平都显著 提高。garcia等报道感染第3天和第5天给鸡注射il-2可使卵囊排 出量减少。ifn-y是具有抗病毒

13、、影响细胞生长和分化、调节免疫 反应等生物活性的蛋白质。鸡ifn-y主要由活化t细胞和nk细胞产 生，其主要功能为促进mhcii分子表达和抗原提呈，诱导tho细胞向 thl细胞分化而抑制向th2细胞分化，刺激nk细胞并增强其杀伤功 能，促进口噬细胞吞噬功能以及t、b细胞分化和细胞毒性t细胞成 熟，刺激b细胞分泌抗体，从而增强机体免疫功能olillehoj和choi 通过体内和体外试验研究发现，重组鸡ifn-y可显著抑制球虫卵囊 的发育和感染球虫引起的体重减轻。叶秀华等对重组鸡ifn-y抗球 虫作用进行了初步研究，试验结果表明，重组鸡ifn-y对于减轻球 虫感染所造成的生长性能下降、减少卵囊排岀

14、量和肠道病变计分有一 定的效果。此外，叶秀华等还对重组鸡ifn-y对鸡体抗球虫细胞免 疫的作用进行了研究，通过测定重组ifn-y处理组鸡的各项免疫指 标，比如淋巴细胞转化水平，脾脏和盲肠扁桃体的t淋巴细胞数量等, 表明重组鸡ifn-y可显著提高鸡体抗球虫保护性细胞免疫水平。鸡 ifn-y的产生水平已经被用于衡量鸡体对球虫抗原的t细胞反应标 准。从以上可以看出，细胞因了的作用不可忽视。而且人们已经将目 光投向利用细胞因子来治疗球虫病，目前在研究dna疫苗时也克隆插 入某种细胞因子基因构建出免疫调节型dna疫苗来提高疫苗保护效 果，这也为防治球虫病开辟了新途径。2. 3. 2质粒dna骨架中非甲基

15、化的cpg序列dna疫苗中质粒dna具 有显著的佐剂作用，佐剂的作用依赖于质粒dna存在的非甲基化cpg 的免疫刺激序列（iss） o现已证明iss中若含一段cpg序列，则增强 刺激作用。这种免疫刺激作用仅见丁细菌dna,而在脊椎动物dna则 缺乏，可能与细菌比脊椎动物dna有较多的cpg序列频率有关。含cpg 序列的i）na具有激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子如儿t2、 il-18和ifn-x,尤其可调节免疫应答向thl型免疫应答转换，具有 明显的免疫佐剂效应。徐前明等采用细菌cpg dna作鸡球虫弱毒苗 immueox佐剂以探索其应用可行性。将制备的细菌cpg dna和球虫疫 苗immu

16、eox单独或联合免疫接种鸡，分别观察肓肠病变计分、opg和 体增重情况。结果表明用细菌cpg dna作鸡球虫弱毒苗immueox的佐 剂可提高该疫苗免疫保护效果，抗球虫综合指数达到172。2. 4免疫途径、免疫剂量和免疫程序不同的免疫途径不仅会影响d7a 疫苗激发的免疫应答强度，而且也会影响免疫应答的类型。进行dna 疫苗免疫时，通常都是将纯化的裸dna质粒盐溶液直接注射入宿主体 内，而肌肉注射是导入dm疫苗的一种简便而有效的方法。免疫反应 的强度与免疫剂量呈止相关，当用50 100 ug剂量进行肌肉注 射免疫时可获得较好的免疫效果，当用较大剂量时，免疫效果反而下 降。song等对dna疫苗的

17、免疫途径、免疫剂量、免疫程序以及dna疫 苗的稳定性进行了系统的研究。研究结果显示：不同的免疫途径包括 皮下注射、口服、静脉注射、肌肉注射、滴鼻点眼，其中腿部肌肉注 射所产生的免疫保护效果最好;在设置的4个剂量组200 ug> 100 u g、50 ii g、25 ug中，25 ug是免疫保护效果最好的剂量组；在制 定免疫程序时，1周龄首免组比2周龄首免组效果好、加强免疫组与 非加强免疫组效果差别不大、1周龄首免2周龄加强免疫组效果最好; 而将dna疫苗在不同温度（一20 °c、4 °c和室温）下分别保存1个 月、3个月及6个月进行的稳定性试验研究中，dna疫苗在6

18、个月内受温度和保存期影响较小。3鸡球虫dna疫苗研究现状 鸡球虫dna疫苗是将编码球虫保护性抗原的基因直接与dma表达载 体连接，构建重组dna表达质粒，直接用此重组质粒免疫鸡，在鸡体 内直接表达具有免疫原性的蛋白抗原基因，这种体内表达的蛋白与原 核表达的蛋白相比较能够形成止确的折叠，包括翻译后加工修饰过 程，更接近其天然构象，能被免疫系统识别从而达到免疫保护效果。 吴绍强等将etenella bj株保护性抗原基因ta4与etm基因串联 后插入到dna疫苗载体pcdna3. 1中，然后用重组质粒免疫鸡，结果 表明，50 pg的质粒dna就能产生良好的免疫效果，可刺激t淋巴 细胞增值，产生免疫保

19、护，抗球虫指数（aci）在160以上。du等将 e. tenella zj株5401基因构建dna疫苗pcdna3. 1-5401,以致弱沙 门氏菌作为载体进行动物保护性试验，发现利用减毒沙门氏菌为载体 传递dna疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性。构建的dna疫 苗既能诱导机体产生抗e. tenella的抗体，也能够显著增强淋巴细 胞增值水平，aci为164. 98,对e. tenella的攻击具有一定抵抗力。 鲍卫超等将e. acervulina的q -微管蛋白基因片段插入到真核表达 载体pcdna31中，构建了pcdna3. 1-a-tubulin dna疫苗,试验结 果表明，50

20、ug的dna疫苗剂量对e. acervulina的攻击有一定保 护作用，aci为164,可使鸡卵囊排出量降低34. 4%,病变积分下降 33. 3%o ding等用etmic-2基因构建的etmic-2-pcdna免疫鸡，结 果发现该dna疫苗不仅对e. tenella的感染具有免疫保护作用，而 且对e. acervulina的感染也有交叉保护作用。由于儿-2或tfn-y 等细胞因子在抗球虫感染中发挥着重要作用，因此，将细胞因子与球 虫保护性抗原基因联合插入到dna疫苗载体中，构建成免疫调节型dna疫苗，产生的免疫保护效果要明显优于单独构建的dna疫苗。geriletu等从etenella第二

21、代裂殖子中克隆出mz5-7基因，与鸡 il-17基因共同克隆到真核表达载体pcdna4. oc中，构建了 pcdna4. oc-mz 和pcdna4 oc-mz-chil-17 dna 疫苗。动物试验表明， 100 11 g的疫苗剂量对e. tenella的攻击均具有一定保护力，卵囊 减少率分别为60. 4%和65. 99%,病变积分下降分别为62. 5%和60%, aci分别为186和190。和对照组相比较，dna疫苗组均诱导鸡体脾淋 巴细胞高水平转录il-2 和ifn- y mrna,而pcdna4. oc-mz-chil-17 疫苗组和pcdna4. oc-mz疫苗组相比较,差异显著。x

22、u等将e. tenellata4 基因构建了dna 疫苗pcdna3 lb-ta4-chil-2,用100 u g剂量免疫动物，结果显示，相对增重率为97. 3%,卵囊减少率为75. 1% , aci 为 192 o song 等对 e. tenella dna 疫苗 pcdna3. lb-ta4-chil-2的交叉免疫保护性进行了研究，结果表明，构建的疫 苗对e. acervulina 和e necatrix 的aci 分别为 164. 91 和 170.26,但对e. maxima的act为86. 82,说明该疫苗对e. acervulina和 e. necatrix感染有部分交叉免疫保护

23、作用，对e. maxima感染没有 交叉免疫保护作用。song等31从e. acervulina第一代裂殖子 中克隆出乳酸脱氢酶（ldh）基因，构建了pvaxldh-chlfn- y和 pvax-ldh-chil-2疫苗,100 ug剂量免疫试验动物，结果显示，卵 囊减少率分别为56. 82%和57. 59%, act分别为166. 68和168. 78。 song等32还对构建的dna疫苗诱导的细胞因子的变化情况进行 了研究，发现pvax-ldh-chlfn-y 和pvax-ldh-chil-2 均诱导脾脏和盲肠扁桃体中thl型细胞因了il-2和ifn-y mrna高水平转录， 与对照组相比差异显著。muhammad等33从e. acervulina抱子 化卵囊中克隆出csz-2基因，构建了 pvaxl-csz-2、 pvaxl-csz-2-chil-2 和pvaxl-csz-2-chifn- y 疫苗，动物试验结果 表明，卵囊减少率分别为63. 3%、80%和62. 4%, act分别为173、 192 和 171 o muhammad 等 34 还将 pvaxl-csz-2 和 p