new实验七GST酶亲和层析及学习教案

1、会计学1new实验实验(shyn)七七GST酶亲和层析及酶亲和层析及第一页，共44页。1. 蛋白质分离(fnl)纯化2. 蛋白质的鉴定(jindng)分析第1页/共43页第二页，共44页。蛋白质分离(fnl)纯化的方法第2页/共43页第三页，共44页。等电点沉淀法聚乙二醇沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法热变性沉淀法1电泳法2层析法3沉淀法4透析、超滤5、离心(lxn)6、结晶第3页/共43页第四页，共44页。n主要是利用(lyng)盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。一、粗分级分离第

2、4页/共43页第五页，共44页。水的活度降低，原来溶液中大部分水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子从而降低蛋白质极性基团与水分子(fnz)(fnz)之间的作用，破坏蛋白质之间的作用，破坏蛋白质分子分子(fnz)(fnz)表面的水化层。表面的水化层。l盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。即仍有活性。第5页/共43页第六页，共44页。第6页/共43页第七页，共44页。 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水(缓冲液)中进行，可不

3、断更换蒸馏水，直至(zhzh)杂质被除去。透析袋蛋白质溶液蒸馏水第7页/共43页第八页，共44页。第8页/共43页第九页，共44页。第9页/共43页第十页，共44页。电泳电泳(IEF)。n另外，结晶也是蛋白质分离纯化的另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。蛋白质结构分析之用。第10页/共43页第十一页，共44页。综合(zngh)实验第11页/共43页第十二页，共44页。抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。第12页/共43页第十三页，共44页。第13页/共43页第十四页，共44页。

4、Affinity chromatography 亲和层析Solid Matrixligand第14页/共43页第十五页，共44页。亲和层析法分离(fnl)生物大分子示意图配基 待分离的 生物分子a. 载体 手臂 配基 亲和吸附剂b.第15页/共43页第十六页，共44页。d.与待分离物质专一可逆结合的物质c.样品杂质 第16页/共43页第十七页，共44页。亲和层析的示意图第17页/共43页第十八页，共44页。Glu-Agarose beads 原理谷胱甘肽(Glutathione，Glu)与谷胱甘肽转移酶( Glu S-Transferase )之间具有特异性的作用力。将混合菌体蛋白与谷胱甘肽琼

5、脂糖凝胶珠（Glu-Agarose beads）孵育，凝胶手臂上的Glu可以与GST蛋白特异性结合，通过洗脱除去不能与珠结合的杂蛋白而获得琼脂糖珠结合的GST纯蛋白。进一步使用还原型谷胱甘肽(GSH)洗脱时，将竞争GST上的结合位点而将GST蛋白洗脱下来，从而(cng r)获得纯化的GST酶的纯品。 第18页/共43页第十九页，共44页。 将菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，离心后弃上清。第19页/共43页第二十页，共44页。含有50l 50% Glu-Aragrose beads的EP管中，混匀管内液体，振摇反应5min后，2000g离心1min，然后小心去除珠子(zh zi)上方的上清溶

6、液。在Ep管中加入预冷的PBS洗液1ml悬浮珠子(zh zi)，2000g离心1min，小心去除上清溶液，重复用PBS洗珠子(zh zi)8次以上, 最后一次用5000g 离心2min。最后将珠子(zh zi)上方的溶液尽量吸干净，注意操作中尽量避免珠子(zh zi)被溶液带走。在收集的珠子(zh zi)中加入20l GSH溶液悬浮珠子(zh zi)（注意不要颠倒Ep管，以免珠子(zh zi)粘在管壁上），室温反应5min后，10000g离心1min后收集上清溶液（即纯化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子(zh zi)的Ep管）第20页/共43页第二十一页，共44页。第21页/共43

7、页第二十二页，共44页。第22页/共43页第二十三页，共44页。核黄素B1 还原型 游离(yul)基 聚合反应光照O2第23页/共43页第二十四页，共44页。丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝胶催化剂聚合反应(j h fn yng)第24页/共43页第二十五页，共44页。单体丙烯酰胺Acr交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis化学聚合光聚合引发剂（NH4)2S2O8 （NH4)2S2O8 核 黄 素 加速剂TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8 过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应 TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺 DMAPN二甲基胺基丙

8、晴 聚合为含酰胺基侧链的脂肪(zhfng)族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而成的三维网状结构物质第25页/共43页第二十六页，共44页。单体(dn t)和双体在凝胶中的总浓度a+bV 100%T双体占总浓度(nngd)的百分含量，即交联度bab 100%Ca，Acr的质量（g）b，Bis的质量（g）V，溶液的体积（ml） CT：520孔径大小第26页/共43页第二十七页，共44页。蛋白质相对(xingdu)分子质量与凝胶浓度的关系蛋白质相对分子质量范围(kD)适用的凝胶浓度（T%）1020301040152040100101510050051050025 凝胶浓度(nngd)的选择第27页

9、/共43页第二十八页，共44页。聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构稀溶液(rngy)浓溶液(rngy) 交联剂 凝胶 结点(ji din)第28页/共43页第二十九页，共44页。可分离：1.电荷性质与密度相近的但分子量有差别 2.分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别 的分子 3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同不连续(linx)凝胶电泳洗脱 碱性不连续(linx)分离酸性样品 酸性不连续(linx)分离碱性样品 第29页/共43页第三十页，共44页。第30页/共43页第三十一页，共44页。第31页/共43页第三十二页，共44页。第32页/共43页第三十三页，共44页。SDS-PAGE第33

10、页/共43页第三十四页，共44页。DTT硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。第34页/共43页第三十五页，共44页。SDS-PAGE鉴定酶蛋白(dnbi)纯度第35页/共43页第三十六页，共44页。 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的烧杯.2. 把玻璃板在灌胶支架上固定好. 固定玻璃板时，两边用力(yng l)一定要均匀，防止夹坏玻璃板.3.按比例配好分离胶,用滴管快速加入, 之后加少许蒸馏水封胶,静置3040分钟.配制凝胶要迅速,

11、 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝胶无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免凝胶不均匀.封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，促使凝胶聚合过程；凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, 按比例配好浓缩胶,连续平稳加入分离胶面上,迅速插入样梳,静置40分钟. 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.第36页/共43页第三十七页，共44页。 10% AP 100 l 10%TEMED 100 l 配胶，先配分离胶，再陪浓缩(nn su)胶。（在孵箱里或水浴锅中聚合）10%分离(fnl)胶配方：（10ml,一块胶）第37页/共43页第三十八页，共44页。ddH2O 3.345 ml30%凝胶贮液 0.8 ml浓缩(nn su)胶buffer 0.625 ml10%SDS 50 l10% AP 50 l10%TEMED 50 l第38页/共43页第三十九页，共44页。 操作步骤第39页/共43页第四十页，共44页。什么?n在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?第40页/共43页第四十一页，共44页。第41页/共43页第四十二页，共44页。第42页/共43页第四十三页，共44页。NoImage内容(nirng)总结会计学。常用