Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测(1)

1、Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰【摘要】目的：扩增Id1启动子基因，构建Id1启动子的报告基因载体.方法：通过PCR及双酶切方法，从HepG2 细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度 碱基的两段Id1启动子序列；分别克隆到报告基因pGL3enhancer载体上，构建包含两段不同长度Id1启动子的报告 基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝 癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果：经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1

2、启动子片段，序列测定其编码 序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确.瞬时转染HepG2后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性.结论：成功构建了 Id1启动子的报告基因载体，为进一步研究 Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.【关键词】分化抑制因子0引言Id蛋白即分化抑制或 DNA吉合抑制蛋白是缺少 DNA吉合 结构域的螺旋环螺旋蛋门，是HLH转录因子的显性负性 调节分子.已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成员.它们可调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、分化、 凋亡和血管生成等1.研究2表明Id蛋白特别是Id1 , 可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳 动物细胞的

3、增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必 需的关键因子.Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险的有用指标，并且可作为治疗肝癌的靶向分子.我们拟构建两段包含不同长度Id1启动子片段的报告基因载体，转染HepG2细胞后检测两段Id1启动子的活性.1材料和方法材料pGL3 enhancer载体，内参照 pRL TK载体和 Dual luciferase reporter Kit ; LipofectaminTM Reagent 和T4 DNA连接酶；细胞基因组 DNA提取试剂盒；高保真 Taq DNA聚合酶；Plasmid Miniprep Kit 和 Gel Extration Kit

4、 ; DNA marker: GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus 和 GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder ; 胰蛋白胨及酵母提取物； 限制性内切酶 Hind川，Kpnl；其余试剂均为国产分析纯. TD20/20荧光照度计；HepG2细胞和JM109菌株均为本实验 室保存.方法启动子报告基因载体的构建引物设计自XX网站数据库检索获得Id1启动子序列的 -3000100部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5端加入Kpn I的酶切位点 GGTAC,在下游引 物5端加入Hind川的酶切位点AAGCTT.从转录起始零点开 始，两段启动子

5、片段长度分别为：1019+ 76和189 + 76. 上游弓丨物分别为Fw1： gggtaccgggagcacgggaactagc和 Fw2: gggtaccccacccttgctgttctga ; 下游 弓丨物 Rv: aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.细胞培养及模板提取将 HepG2细胞用含100 mL/L胎牛 血清的RPMI 1640培养基在 37C, 50 mL/L CO2的孵箱中培 养.收集对数生长期细胞约 1 X 107 ,以细胞基因组 DNA提取 试剂盒提取基因组 DNA.启动子基因的克隆以 HepG2细胞基因组DNA为模板，用 Fw1为上游引物、Rv为下游引

6、物，经预实验选择94 C变性1min, 55C退火1 min , 72C延伸1 min, 共30个循环，获 得一长度为1096 bp的片段，命名为Id1p1 ;选用Fw2为上 游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94C变性30 s, 54C 退火30 s, 72C延伸45 s,共30个循环，获得一长度为266 bp的片段，命名为Id1p2.用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳 获得2条鉴定条带，大小分别约为1100 bp和260 bp.参照试剂盒的操作说明回收并纯化.启动子载体的构建与测序将荧光素酶报告基因pGL3enhancer载体分别行 Kpn I和Hind川双酶切，回收.同时将 之前回收的P

7、CR产物同样经KpnI和Hind川双酶切及琼脂糖凝胶电泳，分别回收约 1100 bp和260 bp条带.使之分别 在T4连接酶的作下与 pGL3 enhancer载体以3 : 1和10 : 1的浓度比于16 C连接12 h，使Id1p1和Id1p2基因序列插 入无启动子的pGL3 enhancer载体中.以低温CaCI2法转 化感受态细菌，涂布于含氨苄青霉素的固体LB培养皿上，12 h后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取质粒.行Kpnl和Hind川双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组质粒.最终构建成重组报告基因载体Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3.启动子载体转染肝癌 HepG2细胞系

8、将两种重组质粒、空 载体pGL3 enhancer和内参照pRLTK载体转化的阳性菌株，在LB培养基中37C摇床培养过夜，按质粒提取说明 分别提取 ld1p1/pGL3 Jd1p2/pGL3、空载体 pGL3 enhancer 和pRL TK的DNA经紫外分光光度仪测定A260 nm值.按照LipofectaminTM Reagent脂质体转染系统说明，于转染前1日将细胞接种于24空板，5X 104/孑L,第2日当细胞约 90%融合时，每孔分别定量加入Id1p1/pGL3卩g, PRL TK内参照载体 100 ng , LipofectaminTM 5 卩L和无血清培养 基 200 卩 L.

9、6 h 后换含 FBS 100 mL/L 的 RPMI 1640,培养 18 h.报告基因活性的检测瞬时转染24 h后收集、裂解细胞，离心取上清，用 Dual Luciferase Reporter Assay System 在TD20/20荧光照度计上测定裂解上清内Luc活性，计算Firefly Luc / Renilla Luc的比值，并以空载体pGL3enhancer转染细胞作对照，进行比较以判断Idlpl和Id1p2启动子活性.2结果目的基因的克隆及测序以肝癌细胞 HepG2基因组DNA为 模板，分别克隆出两段Id1启动子，分别为1096 bp的Id1p1 和 266 bp 的 Id1

10、p2.图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳略启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经Kpn I和Hind川双酶切得到的Id1p1和Id1p2两重组质粒和 pGL3 enhancer载体的相应条带，经 T4连接酶连接后转化感受态 细菌.再经Kpn I和Hind川酶切后，两种重组质粒分别释放 出1096 bp和266 bp大小的片段.测序结果亦证实两段均 包含Id1启动子序列.表明包含不同长短的Id1启动子报告 基因载体构建成功.图2双酶切重组质粒琼脂糖电泳略转录活性的检测两段Luc报道基因载体转染细胞均表现有Id1启动子活性，空载体pGL3 enhancer对照为,Id1p1 为，Id1p2为，二启动子活

11、性分别较对照升高倍和倍 .对结 果分析表明，两段均包含核心启动子部分.而Id1p1显示更 高的启动子活性.3讨论HLH转录因子具有调节细胞生长分化的重要作用，大多 数HLH蛋白属于碱性的bHLH家族，具有高度保守的HLH结构域和碱性 DNA结合区.Id 蛋白是碱性 DNA结合区缺失的 bHL H蛋白，它与bHL H形成异源二聚体后即丧失结合DNA的能力，从而抑制了下游含有 Ebox DNA片段的基因的转录，因而在功能上Id是这类转录因子的显性负性调节蛋白.能与Id蛋白结合的分子可以分为两大类，包括组织普遍表达 的E47和组织特异性表达的 MyoD. Id与后一类分子结合能 力远远强于前者，但目

12、前发现的这类分子屈指可数研究表明，转染外源性Id1的鼻咽癌细胞、前列腺癌细 胞和卵巢癌细胞的增殖率和S期细胞所占比例升高3.异常表达Id1的前列腺癌细胞中 p16INK4a水平降低，CDK和磷 酸化RB蛋白水平升高，提示Id1可能通过p16INK4a/pRB途 径促进肿瘤细胞增殖4.另一实验则表明Id1也可能通 过激活MAPK途径诱导肿瘤细胞增殖5 . Id1的异常过表 达还可诱导乳腺癌细胞持续增殖，当下调 Id1表达时可导致 细胞周期素cyclinD1 和cyclinE 的表达下降和 cyclinE Cdk2活性降低，以及pRB的Ser780位点的磷酸化程度降低， 这与下调cmyc蛋白表达的

13、作用效果类似，提示Id1也可能参与cyclinD对cmyc蛋白表达依赖途径从而促进细胞周期进程，诱导肿瘤细胞增殖6.而当阻断Id1 , Id2和Id3蛋白表达时，人结肠腺癌S期细胞比率降低，且与阻断量负相关7.此外，研究发现，Id1和Id2在高度侵袭性 前列腺癌细胞PC3中高表达，而在非侵袭性的LNCaP细胞中低表达，且阻断Id2表达后，可使肿瘤细胞侵袭和增殖能力 降低8.在上皮性卵巢肿瘤中，Id1的表达程度与肿瘤低 分化和高侵袭特性相关，高表达的Id1可提示不良预后相关:9.以上均提示Id蛋白与肿瘤增殖、侵袭和转移能力密 切相关.目前Id蛋白与肝癌相关性的研究仍鲜有报道.初步发现高表达的Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生 风险有价值的指标10.通过组织微阵列研究表明Id1的表达与VEGF表达显著相关，它可通过稳定化处理HIF 1alpha蛋白而介导 VEGF的转录活性.下调VEGF可抑制Id1 从而延缓肿瘤细胞侵袭11.我们成功构建了 Id1两段不 同长度的启动子载体并顺利转染肝癌HepG2细胞系，使受控于Id1启动子的Luc报道基因在HepG2细胞中得