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文档简介

1、Real-Time RT-PCR常见问题分析1 .某一孔荧光信号特别强Data and StandardsAll DyesLog Scale 歹 Auto Scale Smooth:问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因： 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染， 这时就要清除热槽中的污染；2 .扩增曲线有一向上或向下的尖峰Ma问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因： 反应过程中电压不稳定；可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强； 如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所

2、致，这时应更换；3.部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因： 1、模板提取环境有污染。2、模板提取操作有污染。3、配液过程存在污染。问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染;10.山坡形曲线问题：直线型扩增曲线？原因：探针部分降解 （探针降解原因：a.探针反复冻融一一稀释的探针可在4c保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有PCR抑 制物;6.没有扩增曲线Amp PlotC

3、omponent问题：没有扩增曲线？原因：PC替数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；电脑设定了自动休眠；问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致;8.扩增曲线断裂扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板 DNA浓度过高所致，因Ct值15,而基线范围仍取 315,其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据9.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同 “扩增曲线断裂”。山坡形扩堵曲畿_ 一” 一 =二r，- *, r 0&

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