DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制

1、1会计学DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制限制酶切反应和限制酶谱绘制 ii. 限制酶的纯度和稳定性限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性：保存和反应稳定性：保存和反应 iii. 反应缓冲液反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（常用三种核心缓冲液，即高（H），中（），中（M），），低（低（L）盐缓冲液，不同温度下的）盐缓冲液，不同温度下的pH值值 iv. 反应温度反应温度：大多数为大多数为37 v. 双酶切和多酶切反应双酶切和多酶切反应 同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用

2、的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者-分别酶切。分别酶切。 i) 第一种酶切第一种酶切 电泳检查电泳检查 酚酚/氯仿纯化氯仿纯化 第二种酶切。第二种酶切。 可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。 ii) 采用低浓度盐缓冲液的限制酶切采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查电泳检查 采用高采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。 假如两酶切位点相距很

3、近（如多克隆位点区），首先考虑假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。其结果大不相同。 如如SmaI-BamH(c), BamHI-SmaI(p)第2页/共51页二、限制酶图谱的绘制二、限制酶图谱的绘制 1. 完全酶切作图法完全酶切作图法 1）单酶切作图法单酶切作图法 一长度为一长度为5Kb的线状的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用

4、下述辅助方法之一。辅助方法之一。 i. 单酶部分酶切单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。片段才有可能出现在凝胶上。 第3页/共51页 ii. 末端标记完全酶切末端标记完全酶切 DNA片段片段 末端标记末端标记 完全酶切完全酶切 凝胶电泳凝胶电泳 EtBr染染 色观察色观察 放射自显影放射自显影 2) 双酶切作图法双酶切作图法 单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行在一张图上时则不行第4页/共51页分别作图时，

5、同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图酶切反应，其结果见图 根据上述的原理和步骤，前述的根据上述的原理和步骤，前述的5 Kb片段酶片段酶I与酶与酶II的定位的定位结果可用两种方法之一：结果可用两种方法之一： i) 单酶切单酶切 分离分离DNA片段片段 第二种酶切第二种酶切 凝胶电泳凝胶电泳 ii)单酶切单酶切 第二种酶切第二种酶切 凝胶电泳凝胶电泳 * *如果要同时将两种限制酶定位在一条如果要同时将两种限制酶定

6、位在一条DNADNA上时，单酶完全酶切上时，单酶完全酶切作图就没必要了。作图就没必要了。 第5页/共51页 2. 末端标记末端标记-部分酶切作图法部分酶切作图法（Smith-BrinstielSmith-Brinstiel法）法） DNA片段片段 末端标记末端标记 酶酶1切切 分离带标记分离带标记DNA片段片段 酶酶2部分酶部分酶切切 电泳电泳 EtBr染色染色照相照相 放射自显影放射自显影 结果结果 单端标记方法单端标记方法: 人工合成单端标记法人工合成单端标记法 限制酶切单端标记法限制酶切单端标记法第6页/共51页单端标记方法单端标记方法1 人工合成单端标记法人工合成单端标记法第7页/共5

7、1页单端标记方法单端标记方法2 限制酶切单端标记法限制酶切单端标记法第8页/共51页 3. 末端标记双相作图法末端标记双相作图法方法方法2仍存在两个不足之处：仍存在两个不足之处：酶酶1的选择不能靠近的选择不能靠近DNA中央；需先分离中央；需先分离DNA片段，片段，该法可克服上述缺点。该法可克服上述缺点。 现假设有一片段长现假设有一片段长10 Kb，其中其中RE1有三个切点，有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是有一个切点，其图谱可能是:第9页/共51页4. Bal31顺序酶解作图法顺序酶解作图法 DNA片段片段 Bal31处理不同时间取样终止反应处理不同时间取样终止反应 限制酶切限制酶切

8、凝胶电泳凝胶电泳 染色观察结果染色观察结果5. 切口移位作图法切口移位作图法(可检测出可检测出100bp片段片段) 双链双链DNA 切口移位切口移位 限制酶切限制酶切 电泳电泳 放射自显影放射自显影第10页/共51页6. 大尺度限制酶作图大尺度限制酶作图 1) 条件条件 i. 电泳方法电泳方法-脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 ii. 样品制备样品制备-原位原位DNA制备和酶解制备和酶解 iii. 人工染色体构建人工染色体构建-pYAC载体构建载体构建 iv. 脊椎动物基因组中的脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的和植物基因组中的CpXpG序序列存在列存在 2) 一般作图程序一般作图程序 原位

9、原位DNA样品制备样品制备 原位原位DNA限制酶切限制酶切 脉冲场凝脉冲场凝胶电泳胶电泳 染色染色 观察观察 3) 大尺度作图用酶大尺度作图用酶 i. 稀有识别序列内切酶稀有识别序列内切酶-I型内含子内切酶型内含子内切酶 (真菌细胞核真菌细胞核和线粒体基因组和线粒体基因组,T4噬菌体噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体衣藻叶绿体和线粒体)；酵母；酵母HO内切酶；大肠杆菌内切酶；大肠杆菌recA 虽然这些内切酶识别的序列都很长：虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19 bp，但高，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用 第11页/共51页 i

10、i. II型限制酶型限制酶 人基因组有人基因组有45,000个个CpG岛岛,一个长度约为一个长度约为1.5 kb富含富含GC的的DNA片段片段,其中只有其中只有25%的的CpG岛未被甲基化岛未被甲基化,这些这些CpG岛常位于基岛常位于基因的因的5-端端,未被甲基化的未被甲基化的CpG岛平均长约岛平均长约270 kb 可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或或6 bp序列；富含或只含序列；富含或只含GC序列；含有序列；含有CpG序列序列 i) AscI-GGCGCGCC和和NotI-GCGGCCGC ii) FseI-GGCCGGCC和

11、和SrFI-GCCCGGGC iii) SfiI-GGCCNNNNNGGCC iv) CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCG v) BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和和SacII-CCGCGG vi) NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGG vii) MluI-ACGCGT, NruI-TCGCGA, PvuI-CGATCG, SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3第12页/共51页三三. 限制酶图谱的用途限制酶图谱的用途 1. 基因工程中的应用基因工程中的应用 1) 克隆载体图谱克隆载体图谱,便于便于DNA重组

12、重组; 2) 克隆片段图谱可用于次克隆克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变体外突变,基因定位基因定位,核酸定序核酸定序. 2. 突变体检测突变体检测 遗传学图谱必须依赖各种突变体存在遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了因此必然发生了基因型和基因型和表型的变化表型的变化. 限制酶图谱限制酶图谱不必依赖表型变化不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了酶谱的变化一定是基因型发生了变化变化,但不一定发生了表型变化但不一定发生了表型变化,即即表型的变化不一定会导致酶谱表型的变化不一定会导致酶谱变化变化.1) 缺失突变体的检测缺失突变体的检测:某某DNA片段消失片段消失,代之以一较小代之以

13、一较小DNA片段片段.2) 插入突变体的检测插入突变体的检测:某某DNA片段消失片段消失,代之以一较大代之以一较大DNA片段片段. 第13页/共51页缺失和插入突变体的检测（缺失和插入突变体的检测（I）I II点突变的检测（点突变的检测（II）第14页/共51页 3）点突变的检测）点突变的检测: 某某DNA片段消失片段消失,代之以两较小的代之以两较小的DNA片段片段.前者的长度等于后两者长度之和前者的长度等于后两者长度之和(位点增加位点增加)；某两；某两DNA片段消片段消失失,代之以一较大代之以一较大DNA片段，前者的长度之和等于后者长度片段，前者的长度之和等于后者长度(位位点消失点消失).

14、3. 重组频率的测定重组频率的测定 同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗从而构成遗传多型性传多型性.等位基因的限制酶谱也可能具有多型性等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制这就是限制酶片段长度多型性酶片段长度多型性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)不同个体不同个体 总总DNA限制酶完全酶切限制酶完全酶切Southern印迹印迹杂交杂交 结果分析结果分析第15页/共51页 当不同个体交配时当不同个体交配时,除自由组合外除自由组合外,也可发生重组也可发生重组,如不同

15、如不同果蝇交配时果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为其后代的表型和限制酶谱可为: 表型表型 红红:白白=1:1, 限制酶谱限制酶谱 30%个体已发生了重组个体已发生了重组. 4. 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 分析正常人与遗传病患者的某些分析正常人与遗传病患者的某些DNA片段的限制酶谱片段的限制酶谱,便可发便可发现其差异现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是便可判断其是否患有此病否患有此病.第16页/共51页第五节第五节DNA 的的

16、 连连 接接 第17页/共51页一一. DNA的连接方法的连接方法 两种不同的两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接分子可以经过下述的方法之一进行连接,而而方法的选用则是根据其两者末端的方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构结构. 1. 直接连结法直接连结法-该法适用于该法适用于: 1) 同种限制酶作用不同同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相同粘性末端相同粘性末端 重组重组DNA可用同种酶再切开可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外但识别简并序列的限制酶除外(如如AraI) 2) 不同种限制酶作用不同不同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相容性末端相容性末

17、端 i.重组重组DNA分子不能再为这两种酶所作用分子不能再为这两种酶所作用,如如:BamHI/BglII ii.重组重组DNA分子可为其中一种酶所作用分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用但为另一种酶作用的可能性较小的可能性较小,如如MboI/BamHI 3) PCR产物与特定载体的连接产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的限制酶和其他方式产生的平整末端平整末端.第18页/共51页2.人工接头连接法人工接头连接法1) 人工接头（人工接头（linker）的结构）的结构 i. 中轴对称互补中轴对称互补,可自行退火形成双链可自行退火形成双链.如如: 5-CCGGAATTCCGG- 3

18、 3-GGCCTTAAGGCC-5 ii. 至少有一特定的限制酶识别位点至少有一特定的限制酶识别位点 iii. 某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相同相.如如: 八聚体八聚体 d(GGAATTCC) 十聚体十聚体 d(CGGAATTCCG) 十二聚体十二聚体 d(CCGGAATTCCGG)2) 用途用途 i. 平整末端的连接平整末端的连接(各种结构的各种结构的DNA末端均可经过修饰变成末端均可经过修饰变成平整末端平整末端) 2 X 5-CCGGAATTCCGG-3退火退火第19页/共51页 ii. 产生新的克隆位点产生新的克隆

19、位点 iii. 合成匹配接头合成匹配接头3) 连接方法连接方法 人工接头磷酸化人工接头磷酸化 退火形成双链退火形成双链 与目的与目的DNA相连相连 限制限制 酶切酶切 两两DNA分子相连分子相连4) 适用范围适用范围 人工接头连接法适合于那些只有一种人工接头连接法适合于那些只有一种DNADNA片段需加人工接头片段需加人工接头就可以与另一就可以与另一DNADNA分子相连的分子相连的DNADNA分子分子. .利用人工接头也可使任意利用人工接头也可使任意两个平端的两个平端的DNADNA分子相连分子相连. .这种直接相连的办法简便这种直接相连的办法简便, ,快速快速, ,但最后但最后连接起来的连接起来

20、的DNADNA可能具有不同的结构可能具有不同的结构. .为避免这些结构的产生为避免这些结构的产生, ,可可先使一种先使一种DNADNA先加上人工接头后先加上人工接头后, ,再与另一种再与另一种DNADNA分子相连分子相连. .第20页/共51页3. 匹配接头连接法匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子分子,但这些末端在但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端加入人工接头前必须变为平整末端.然而然而,有时实验不容许使用人有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便工接头或使用人工接头不方便,此时此时,便可使用匹配接头便可使用匹配接头,它可

21、用于它可用于直接连接各种具不同末端的直接连接各种具不同末端的DNA分子分子:i. 平端平端 + 突起末端突起末端(5-突起突起, 3-突起突起)ii.粘性末端粘性末端 (5-突起突起 + 5-突起突起: EcoRI+HindIII 5-突起突起 + 3-突起突起: EcoRI+PstI 3-突起突起 + 3-突起突起: PstI+SacI)1) 匹配接头的结构特点匹配接头的结构特点 i. 由两个低聚核苷酸组成由两个低聚核苷酸组成 ii. 部分区域可以互补部分区域可以互补 iii. 退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2) 匹配接头的种类匹配接

22、头的种类第21页/共51页 i. 预制匹配接头预制匹配接头(连接平端和粘性末端连接平端和粘性末端) 人工接头人工接头 + 匹配接头匹配接头 预制匹配接头预制匹配接头 ii. 转换匹配接头转换匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-突起末端突起末端) 二匹配接头退火二匹配接头退火 转换匹配接头转换匹配接头 二人工接头二人工接头 连接酶连接酶 双酶切双酶切 转换匹配接头转换匹配接头 iii. 单链匹配接头单链匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)4. 同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法 在两个不同的在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物分子末端各加上一个可互补的同聚物,即

23、即AT或或GC.5. 连接方法的选择连接方法的选择 方法选择的依据方法选择的依据: 1) 两两DNA分子的末端结构分子的末端结构 2) DNA 分子的限制酶谱分子的限制酶谱 3) 是否需要回收是否需要回收DNA片段片段第22页/共51页连接方式的选择连接方式的选择载体末端载体末端 外源外源DNA末端末端 常规连接常规连接 脱磷酸化脱磷酸化 同聚物同聚物 平端连接平端连接 补齐补齐,人工接头人工接头 结构结构 结构结构 载体载体 加尾加尾 外切酶外切酶 5-突起突起 相容相容5-突起突起 第二选择第二选择 第一选择第一选择 不能不能 不能不能 不能不能 5-突起突起 非相容非相容5-突起突起 不

24、能不能 结合使用接头结合使用接头 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 3-突起突起 相容相容3-突起突起 唯一选择唯一选择 不能不能 不能不能 不能不能 不能不能 3-突起突起 非相容非相容3-突起突起 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择 或平端或平端 3-突起突起 5-端突起端突起 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择 (补齐后补齐后) 平端平端 平端平端 不能不能 可能可能 可能可能 第一选择第一选择 可能可能 平端平端 3-或或5-突起突起 不能不能 不能不能 第一选择第一选择 不能不能 第二选择第二选择第23页/共51页二二.

25、 DNA的连接反应的连接反应 1. 连接反应理论连接反应理论 当两种当两种DNA分子相连时分子相连时,它们可能产生不同的结果它们可能产生不同的结果,这些结这些结果与以下因素有关果与以下因素有关: 1) 连接反应系统中的总连接反应系统中的总DNA浓度浓度i 2) 一个一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度分子靠近同一分子另一端的有效浓度j, 该值与该值与DNA的长度成反比的长度成反比,即即DNA分子越大分子越大,该分子的两末端越不该分子的两末端越不易相互作用易相互作用(即自身环化即自身环化) 3) 两种不同两种不同DNA分子的克分子浓度之比值分子的克分子浓度之比值. 2. 连接反应条件连接反

26、应条件 1) 评估连接反应结果的方法评估连接反应结果的方法 i. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化大肠杆菌转化 2) 反应条件反应条件第24页/共51页 i. 温度温度 ii. ATP浓度浓度 iii. 时间时间 iv. 连接酶浓度连接酶浓度 v.克分子比率克分子比率第25页/共51页 第六节第六节 PCR 技技 术术第26页/共51页一一DNA 体外扩增技术体外扩增技术 1. PCR反应体系反应体系 1) 基本原理基本原理(PCRPolymerase Chain Reaction 聚合酶聚合酶链式反应链式反应) 一个一个DNA经经n次扩增后次扩增后, 一个一个DNA分子可变为

27、分子可变为2n个分子个分子DNA扩增需要对待扩增的扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 2) 基本操作基本操作 待扩增的待扩增的DNA片段片段+dNTP+TrisHCl缓冲液缓冲液+两引物两引物 90变性变性30 50退火退火30 加入加入Taq DNA聚合酶聚合酶 75 1 进入第二次循环进入第二次循环 25-30次循环次循环第27页/共51页90变性解链与引物退火，50引物及延伸，75n次扩增第一次循环第二次循环3535355353355335335335553553

28、90变性解链与引物退火，505335533553355335引物及延伸，753353355533533555PCR原理示意图原理示意图第28页/共51页2. PCR产物的鉴定产物的鉴定 1) PCR产物的大小和限制酶谱分析产物的大小和限制酶谱分析 bp bp500100600500100RE2) 寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析分析，Oligomer Restriction analysis） OR分析对于分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用测极其有用第29页/共51页GACTCCTG GCTGAG

29、GAC CAT33GACTCCTG GCTGAGGAC CTA533555beta A beta S GACTCCTG GATCTGAGGAC C3355*GACTCCTG GAACTGAGGAC C3355*CTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GAGACTCCTG GAACTGAGGAC C3355* GGAC CACTCCTG GAA3355*GCTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GAHinfIDdeI变性/与标记寡核苷酸探针复性8 n.t3 n.tPCR产物的产物的OR鉴定鉴定第30页/共51页3) 分子杂交分子杂交 适合于检测适合于检测PCR产物的非限制酶位

30、点上碱基突变。它是利产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性用两条引物链间的特异性DNA片段作探针片段作探针(常为人工合成的一段常为人工合成的一段低聚核苷酸，约低聚核苷酸，约20 n.t.).当这种探针的核苷酸序列与待测的当这种探针的核苷酸序列与待测的DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（性寡核苷酸探针（allele-specific Oligonucleotide, ASO）与）与PCR产物进行杂交，可检测出产物进行杂交，可检测出PCR产物的碱基突变。产物的碱基突变。 可直接利用斑点

31、杂交方法用于基因型分析可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析110bp -珠蛋白PC03 19A 19S 19C PC0419A 19S 19C AAASSSSCCCACXXAAASSSSCCCACXXPC03:ACACAACTGTGTTCACTAGCPC04:CAACTTCATCCACGTTCACC19CA:CTCCT AGGAGAAGTCTGC19ST:CTCCTG GGAGAAGTCTGC19A:CTCCTGAGGAGAAGTCTGC第31页/共51页 4) 核苷酸序列分析核苷酸序列分析 DNA扩增产物扩增产物 变性变性 与末端标记的扩增引物或定序与末端标记的扩增引物或定序引物退火引物退火

32、 双脱氧核苷酸链终止反应，测定双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列序列55335353535变性与引物退火dNTP,ddNTP,Klenow frag.A C G TPCR扩增产物第32页/共51页二二Taq DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分中分离纯化而得。该酶的分子量为离纯化而得。该酶的分子量为63-68 kD 1. 无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切切酶活性酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的，但具有依赖于聚合酶活性的5 3外切酶活性外切酶

33、活性 2. 最适反应温度为最适反应温度为80 3. 最适最适pH8.0和最佳反缓冲液和最佳反缓冲液TrisHCl 4. 最佳二价阳离子最佳二价阳离子Mg2+ （10 mM） 5. 具良好的热稳定性：在具良好的热稳定性：在90下连续反应下连续反应30分钟仍有分钟仍有70%的酶活的酶活第33页/共51页50 100 150 温度掺入的 H-dNTTP微克分子数3相对酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反应时间（分）掺入的 H-dNTTP微克分子数320 40 60 80 25 50 75 Mg二价阳离子浓度（mM)Mn+掺入的 H-d

34、NTTP微克分子数3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1. 25 mM磷酸缓冲液2. 25 mMTris-HCl缓冲液3. 25 mM甘氨酸缓冲液Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性第34页/共51页当采用当采用Taq DNA聚合酶进行聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：体外扩增时，必须考虑到以下五个参数： 1）热稳定性热稳定性：在：在PCR循环中循环中DNA的变性时间常为的变性时间常为30-60，若循环，若循环30次，其累次，其累计加热变性时间为计加热变性时间为15-30。Taq DNA聚合酶在聚合酶在90下保温下保温30仍具有仍具有70%酶酶活性，可大

35、大减少操作步骤，活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化易于实现自动化*2）模板与引物的特异性模板与引物的特异性：当：当退火温度和退火温度和DNA链延伸链延伸时温度时温度偏低偏低时，引物与时，引物与模板配对的模板配对的特异性大大降低特异性大大降低，从而导致一些不需要的，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于Taq DNA聚合酶聚合酶最适反应温度为最适反应温度为80，退火温度可提高到，退火温度可提高到55以上以上，由此大大减少了引物，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使与模板的非

36、专一性结合，使产物均一性大大增加产物均一性大大增加*3）合成产率合成产率：反应底物和产物在：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入聚合反应进入平台期平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用利用Klenow片段进行片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2105，当采用当采用Taq DNA聚合酶时，扩增聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大次后才进入平台期，拷贝数可大4106*4）延伸长度延伸长度：有时为了获取较长：有时为

37、了获取较长DNA片段的扩增，这就要求片段的扩增，这就要求DNA聚合酶聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250 bp时，时，Klenow片段和片段和T4聚合聚合酶扩增产率大大降低。利用酶扩增产率大大降低。利用T7 DNA聚合酶聚合酶，可使扩增片段达，可使扩增片段达2 Kb。当利。当利用用Taq DNA聚合酶聚合酶时，最长延伸长度为时，最长延伸长度为4.4 Kb.第35页/共51页 经改造的经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出聚合酶可扩增出40 kb的的DNA 片段片段. 5）扩增产物的可靠性扩增产物的可靠性：评估：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制聚合

38、酶的一个重要指标是它复制DNA的可的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为片段的错误掺入率为10-4，Taq DNA聚合酶的错误掺入率为聚合酶的错误掺入率为510-3 ，而，而T4聚合酶的错误掺入率为聚合酶的错误掺入率为10-7。 *注：注：1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些含量较高，退火的温度可以高些，反之则低反之则低些。退火温度越高，引物些。退火温度越高

39、，引物与模板（即扩增的与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。片段的扩增。 引物的长度常为引物的长度常为20-28聚体，其中有聚体，其中有50%以上的以上的GC含量，无自身互补含量，无自身互补序列，特别是序列，特别是3末端不应有内部二级结构，引物加量为每末端不应有内部二级结构，引物加量为每100l l20pmol. *2)出现平台期的原因可能有出现平台期的原因可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；：后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；引物耗尽；dNTP耗尽；产物浓度过高，以致耗尽；产物浓度过高，以致ds-DNA

40、解链后又迅速解链后又迅速退火，不能与引物结合。退火，不能与引物结合。 *3）链延伸长度与延伸时间有关链延伸长度与延伸时间有关，对于，对于Taq DNA聚合酶，每分钟可形聚合酶，每分钟可形成成2000 n.t.或更多。如果要扩增或更多。如果要扩增3-4 Kb的的DNA，在，在72下需将酶延伸时间下需将酶延伸时间增至增至3-4分钟。分钟。第36页/共51页三三PCR方法方法 1. 强化强化PCR（Boosted PCR） 将将PCR分为两个阶段：分为两个阶段： 1）引物与模板之比为）引物与模板之比为107，扩增，扩增20个周期个周期 2）引物与模板之比为）引物与模板之比为1012 1013，再扩增

41、，再扩增10个周期个周期 该法适合于待扩增该法适合于待扩增DNA浓度较低时。浓度较低时。 2.混合寡核苷酸引物混合寡核苷酸引物PCR（mixed oligonucleotide primed amplification of cDNA,MOPAC） 根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一特定特定cDNA进行扩增。进行扩增。 3. 锚定锚定PCR(Anchored PCR，A-PCR)5 3 5 3 3 5PCRTdTdGTP5 3 3 55 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 5第37页/共51页

42、4. 连结连结PCR(ligation mediated PCR) 该法可用于核苷酸序列测定该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用足迹分析技术和测定甲基化作用 DNaseI 变性、引物 链延伸 加接头（引物） 外侧引物内侧引物 连接引物 标记引物第38页/共51页5. 不对称不对称PCR(Asymmetrical PCR)采用不同引物浓度比率，如采用不同引物浓度比率，如50：1，100：1，可得大量拷贝的，可得大量拷贝的ssDNA用于测序用于测序6. GC串串PCR (GC clamp PCR)应用应用变性剂梯度凝胶电泳变性剂梯度凝胶电泳(denaturing gradi

43、ent gel electrophoresis, DGGE)可检测可检测出出DNA片段中一对碱基的变化，在片段中一对碱基的变化，在DNA分子一端加上一分子一端加上一GC串（约串（约40 n.t.）利用它的）利用它的高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内的点突变链中最高解链区内的点突变5 GC 20nt 1 2 3 4 1. 野生型 2-4.突变型第39页/共51页 7.竞争引物竞争引物PCR (competitive oligonucieotide primer (competitive oligonucieotide prime

44、r PCR,COP-PCR)PCR,COP-PCR) 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。片段上是否带有某一已知碱基置换。准确配对引物 错配引物 共同引物 PCR oror模板 模板 or 第40页/共51页模板 PCR 等位基因(无突变) 模板 等位基因(有突变) 无PCR产物8.等位基因专一等位基因专一PCR(Allele specific PCR,ASPCR) 该法可

45、用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。9.反转反转PCR(inverserar inverted PCR) 该法可用于扩增已知该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列序列两侧的未知序列R2 X LigaseY R1 Y X Z R2 R1 P1 Z R2P2第41页/共51页10.反向反向PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR) 主要用于主要用于mRNA的的PCR扩增扩增 mRNA引物15RT53AAA.A3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T53AAA.A53TTT.T

46、535353RT53TTT.TTdT + dGTPGG.GCC.C 限制酶识别序列 限制酶识别序列第42页/共51页 11.加端加端PCR(Add-on PCR) 在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列 12.错配错配PCR（mismatched PCR) 利用该法可在一已知利用该法可在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。入突变。 P1 P3 P2 靶顺序 P4 分别扩增 5 3 3 5 5 3 3 5

47、除去引物变性/复性P1 P4 产生点突变DNAPCR延伸3553第43页/共51页13.重组重组PCR(Recombinant PCR) 利用该法可将不同基因的利用该法可将不同基因的DNA片段连接在一起。片段连接在一起。与基因2启动子同源基因1编码区PCR53变性/复性启动子与基因1编码区同源PCR533553355335链延伸基因23553第44页/共51页14. 基因克隆基因克隆PCR 利用该法可获一完整的利用该法可获一完整的cDNA克隆。克隆。SP6T7PCRIPCRIIPCRIII四四. 定量定量PCR技术技术 1. 基本原理基本原理 N=N0(1+eff)n N-最终拷贝数；最终拷贝

48、数；N0-起始拷贝数；起始拷贝数；eff-扩增效率；扩增效率；n-扩增次数扩增次数 2. 测定方法测定方法 竞争竞争PCR法法(加入已知量的标准物加入已知量的标准物)；RT-PCR-转录法转录法第45页/共51页五五PCR技术的应用技术的应用 1. 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了AT的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代。AT突变还导致限制酶突变还导致限制酶OxaNI位点的消失位点的消失。 利用利用PCR技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如

49、下：技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下： DNA扩增扩增 PAGE 染色染色 观察观察 比较不同个体的结果比较不同个体的结果 限制酶切限制酶切 PAGE 染色染色 观察观察 此法可在此法可在3-4 h获得结果，比常规的获得结果，比常规的Southern杂交法简便、快速。杂交法简便、快速。PrimerOxaNIOxaNIOxaNIASOxaNI294191103扩增产物AA ASSS第46页/共51页2.传染病的诊断传染病的诊断 如果已知某种病原菌如果已知某种病原菌(体体)中的特异性中的特异性DNA片段的核苷酸序列，这个片段就可以用片段的核苷酸序列，这个片段就可以用于于DNA扩增，并利

50、用扩增，并利用DNA杂交或凝胶电泳的方法诊断病原体的存在与否。杂交或凝胶电泳的方法诊断病原体的存在与否。 例如例如AIDS的诊断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要的诊断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要3-4个星期，个星期，采用采用PCR技术则只需一天左右，且准确率高技术则只需一天左右，且准确率高 3.基因的快速克隆基因的快速克隆 根据已知基因序列设计根据已知基因序列设计PCR引物引物,可直接在不同的样品中进行可直接在不同的样品中进行PCR扩增扩增,而不必而不必分离纯化生物样品分离纯化生物样品4. 基因突变基因突变 1）缺失突变）缺失突变 2）插入突变）插入突变 3）点突变

51、）点突变-单点和多点突变单点和多点突变第47页/共51页六六. 等温等温3SR(self-substained sequence replication)反应系统反应系统七七. 等温链取代扩增反应系统等温链取代扩增反应系统(SDA, strand displacement amplification)第48页/共51页T7 RNA pol引物1 + RT535335RNaseH引物25335T7 RNA pol引物2 + RT反义RNA3535引NaseHRT53553353553RTT7 promoterT7 promotermRNA引物15RT引物253AAA.A

52、3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T53AAA.A53TTT.T535353RT等温等温3SR反应系统反应系统(self-substained sequence replication)第49页/共51页GTTGAC533 5 polIK + 3GTTGAC35CA A CTGSSHincII5 5 3GTT GAC35CA A CTGSS链取代HincII5GAC 33GTTG ACS35CA A CTGSS5 5 335CA A CTGSS链取代5G AC S33GTTG ACS35CA A CTGSS5 GTTG ACS等温链取代扩增反应系统等

53、温链取代扩增反应系统(SDA, strand displacement amplification)第50页/共51页3535 T2T1P1P2T1T2PO1IK + dNTP + dNTTPSHincII链取代T2T1变性/与引物复性第51页/共51页6. 大尺度限制酶作图大尺度限制酶作图 1) 条件条件 i. 电泳方法电泳方法-脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 ii. 样品制备样品制备-原位原位DNA制备和酶解制备和酶解 iii. 人工染色体构建人工染色体构建-pYAC载体构建载体构建 iv. 脊椎动物基因组中的脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的和植物基因组中的CpXpG序序列存在列存在 2) 一般作图程序一般作图程序 原位原位DNA样品制备样品制备 原位原位DNA限制酶切限制酶切 脉冲场凝脉冲场凝胶电泳胶电泳 染色染色 观察观察 3) 大尺度作图用酶大尺度作图用酶 i. 稀有识别序列内切酶稀有识别序列内切酶-I型内含子内切酶型内含子内切酶 (真菌细胞核真菌细胞核和线粒体基因组和线粒体基因组,T4噬菌体噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体衣藻叶绿体和线粒体)；酵母；酵母HO内切酶；大肠杆菌内切酶；大肠杆菌recA 虽然这些内切酶识别的序列都很长：虽然这些内切酶识别