大白菜-甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定

1、http: / www. ahs. ac. cn E-mail: yuanyixuebao园 艺学报 2014, 41 (7) : 1355T360Acta Horticulturae Sinica大白菜 甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定李丹丹，李雪红，彭莹，方小雪，万正杰，徐跃进*(华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉430070)摘 要：以甘蓝型油菜作为母本，大白菜作为轮回父本，杂交获得BC1和BC2群体。通过染色体核型分析法从BC2群体中筛选出大白菜一甘蓝型油菜C基因组6号单体异附加系，利用甘蓝型油菜 C连锁 群特异SSFfe记鉴定

2、，确定该单体异附加系中的外源染色体与甘蓝型油菜C6连锁群相对应。关键词：大白菜；甘蓝型油菜；单体异附加系；核型分析；SSR中图分类号：S 634.1 文献标志码：A文章编号：0513-353X( 2014) 07-1355-06Generation and Identification of Chinese CabbageCabbage Type Rape Monomer Alien Addition LineLI Dan-dan， LI Xue-hong， PENG Ying， FANG Xiao-xue ， WAN Zheng-jie ， and XU Yue-jin* ( College

3、 of Horticulture and Forestry， Huazhong Agricultural University ； National Center for Vegetable Improvemen，t Centeral China； Key Laboratory of Horticulture Plant Biology ， Ministry of Education， Wuhan430070， China)Abstract： In this experiment， BC1 and BC2 populations were derived from a distant hybr

4、idization between cabbage type rap( e Brassica napus) and Chinese cabbag(eB. compestrisssp. pekinensis)，usingthe latter as recurrent parent. A Chinese cabbage with cabbage type rape monosomic alien addition line was identified from the BC2 population through karyotype analysis. SSR marker analysis s

5、howed that the monosomic alien addition line was introduced from C-chromosome 6 of cabbage type rape.Key words： Chinese cabbage； cabbage type rape； monosomic alien additional line； karyotype analysis； SSR将大白菜(Brassica compestris ssp.pekinensis) 近缘植物中的优异基因引入其中，是增加其遗传多样性和改良品种的重要途径。甘蓝型油菜(Brassica napus

6、) 是大白菜的近缘种，具抗病性强的特点，同时本试验中所用的材料Eru的优良的细胞质雄性不育材料，将其胞质不育基因转移到大白菜中，将有利于大白菜的育种研究。已有研究表明，芸墓属作物A与C两个基因组的染色体具有较强的同源性(Snowdon et al.， 1997；刘爱华等，2003)，为引进甘蓝型油菜的优良性状，创建大白菜异附加系提供了基础。目前有关大白菜异附加系的创建主要集中在大白菜与结球甘蓝上(顾爱侠 等，2009；吕文欣等，2011)，而对大白菜与甘蓝型油菜异附加系的研究尚未见报道。收稿日期：2014 £4 T4;修回日期：2014 £6巾3基金项目：国家科技支撑计划项

7、目(2013BAD20B06 )* 通信作者Author for correspondence ( E-mail ： xyjho )7期李丹丹等：大白菜一甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定1359本研究中用甘蓝型油菜细胞质雄性不育系EruA#为母本、大白菜自交系D506乍为轮回父本，在蕾期杂交获得F1、BC1和BC2群体，通过染色体压片从BC2群体中成功筛选出大白菜 一甘 蓝型油菜单体异附加系，并运用核型分析和 SSR子标记进行了鉴定。1 材料与方法1.1 试验材料材料为甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料 Eru用口大白菜自交系D506种植于华中农业大 学蔬菜试验基地，2011至2013年的3 4月

8、进行蕾期杂交授粉得到F1、BC1和BC2群体（图1）。 材料创建的具体流程如下：1.2 染色体数鉴定及核型分析取各材料的根尖或子房，在冰水混合物（16 h）或8克基唾咻（ 0.002 mol L-1 , 2 h）中进行预处理，后置于卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸 =3 ： 1）中，室温下固定24 48 h, 4 C保存于70% 乙醇中。观察时取所处理的材料用蒸储水清洗 3次后，在60 C下用1 mol L-1 HCl水解6 12 min, 蒸储水漂洗2 min之后，移植载玻片上，加1滴10%改良苯酚品红溶液，染色3 5 min,常规压片， Olympus-DP-70显微镜下观察照相。选择体细胞染

9、色体数为21条的植株，取5个染色体分散良好、形态和着丝点清晰的细胞，参照李懋学和陈瑞阳（1985）的核型分析方法，用SpotTM Advanced软件进行臂长测量，Photoshopped进行同源染色体配对排列，除随体染色体外按染色体相对长度由大到小排序。与大白菜和甘蓝型油菜的核型参数（Marina et al.， 1998；申书兴等，2006； Xiong & Chris， 2011）对比分析，结合镜检时的观察结果，鉴定染色体类别，确定附加染色体类型。1.3 单体异附加系SSR子鉴定用CTAB法提取异源三倍体杂交种及其亲本和体细胞染色体为21条的植株的基因组 DNA。根据甘蓝型油菜的

10、C深色体特异性标记（Piquemal et al., 2005）,筛选出甘蓝型油菜C基因组连锁 群相对于大白菜特异的26对SSR引物。分别对异源三倍体杂交种及其亲本大白菜、甘蓝型油菜和 单体异附加系进行PCROI。PCR程序：94 C预变性4 min; 94 C变性30 s, 55 C复性30 s, 72 C 延伸 1 min， 30个循环；72 延伸 7 min， 4 保存。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染法检测并照相。2结果与分析2.1单体易附加系的筛选从表1可见，甘蓝型油菜细胞质雄性不育 材料Eru用口大白菜自交系D506勺回 交一代BC1 (AA + 0 9C)群体为分

11、离群体, 其染色体数从20到29不等；染色体数为22 的双单体异附加系株数较多，所占比例为 44%;而染色体数为21的单体异附加系并未 发现。表1 BC1中不同染色体数单株的比例Table 1 The proportion of individual plants in BC1 that havedifferent number of chromosomes染色体数株数比例/%Number of chromosomesNumber of plants Percentage20 3 621 0 022 22 4423 29 25 50通过染色体观察，从甘蓝型油菜 EruA'D506和大白

12、菜D506BC1群体中筛选出双单体异附加系BC1-31 (AA + 2C),然后继续与大白菜 回交，从其回交后代BC2群体中筛选出1株单体异附加系BC2-20 (AA + 1C)(图1)。图1植株形态与体细胞染色体数Fig. 1 Plant morphology and the somatic chromosome number2.2单体异附加系的核型分析对上述BC2-20单体异附加系植株进行核型分析（图2）,并与大白菜和甘蓝型油菜参数对比。BC2-20有5个中部着丝点染色体（1、3、5、6、8）、5个近中部着丝点染色体（4、7、9、10、11） 和1个近端部着丝点染色体（2）组成，其中11号

13、为附加的外源染色体，其臂比值为2.63 （表2）, 与甘蓝型油菜C基因组6号染色体臂比值2.73 （Marina et al., 1998）相近，初步确定附加的1条 外源染色体为甘蓝型油菜C基因组的6号染色体。核型公式为2n = 2x + 1 = 10m + 8sm + 2st （SAT） + 1sm。Fig. 21< 代 II IX1 勺勺* WT O图2单体异附加系（BC2-20 ）的染色体形态及核型图Chromosome shape and karyotype of monosomic alien addition line ( BC2-20 )表2 大白菜一甘蓝型油菜单体异附加系

14、（BC2-20 ）核型参数Table 2 Karyotypic characteristics of Chinese cabbage cabbage type rape monosomic alien addition line(BC2-20 )染色体序号Chromosome No.1 7.14 + 5.66 = 12.80 1.29 m2 9.41 + 2.90 = 12.31 3.24染色体平均相对长度(L + S ) /%Average relative lengthst (SAT)臂比值（长/短）类型Arm ratio （ L/S）Type3 7.72 + 4.49 = 12.21 1

15、.52 m46.25 +3.64= 9.89 1.91sm55.17 +3.86= 9.03 1.39m64.82 +3.56= 8.38 1.35m74.94 +2.40= 7.34 2.12sm84.20 +2.71= 6.91 1.55m94.30 +1.90= 6.20 2.26sm10 4.30 + 1.59 = 5.89 2.71 sm11* 6.55 + 2.49 = 9.04 2.63 sm注：随体长度不计算在内*为异附加染色体。Note : The satellite is excluded in the length of chromosome. * represents

16、the alien addition chromosome.2.3附加染色体的SSR子鉴定利用甘蓝型油菜C基因组相对于大白菜特异的26又tSSR引物（引物名称及连锁群对应关系如表3所示），对亲本甘蓝型油菜EruA、大白菜D506、双单体易附加系BC1-31 （2n + 2）、单体异附 加系BC2-20 （2n + 1）进行扩增。亲本的扩增结果表明，26又tSSRgl物中10对引物在甘蓝型油菜 中有扩增产物而在大白菜中无扩增产物，16对引物在大白菜和甘蓝型油菜中的扩增片段大小不同 （如表3中的上标1' 新示）。表3 SSR引物名称Table 3 The list of SSR marke

17、rs usedC1 LG-C9 CB103441C2 LG-C1 CB100262C3 LG-C5 Na10-G081C4 LG-C3 BRAS0682C5 LG-C4 CB101031C6 LG-C6 CB100101C7 LG-C2 Na12-A011C8 LG-C7 BRAS0192C9 LG-C8 CB101061染色体编号 Chromosome No.连锁群 Linkage group引物名称 Maker name ,BRAS0022,CB102581 , CB102772,Na12-A022 , CB104871,CB105691 , CB103581 , CB105131,CB1

18、02882 , CB101221,CB102112,Na14-H111 , CB103161,CB102681 , CB102971,CB101392 , CB101792注：所用的SSR标记是从已报道的甘蓝型油菜 C-染色体特异性标记(Piquemal et al., 2005)中筛选的。染色体与连锁群的对应关系 参考Heneen等(2012)。上标1表示引物在大白菜和甘蓝型油菜中的扩增片段大小不同；上标2表示引物在甘蓝型油菜中有扩增产物而在大白菜中无扩增产物。Note : The SSR markers used in this study were from reported Brass

19、ica napus C-chromosome specific markers (Piquemal et al. , 2005) Correspondence between chromosome and linkage group was supported by the work of Heneen et al. (2012) . 1 represents the primers that have different sizes of amplified product between Chinese cabbage and cabbage type rape ； 2 represent

20、s the primers that have PCR products in cabbage type rape but not in Chinese cabbage.从图3中单体和双体异附加系的扩增结果发现，BC1-31对位于甘蓝型油菜C基因组的1号和6号染色体连锁群的SSR引物（CB10344、BRAS002和CB10010、CB10211）扩增结果与甘蓝型油菜 一致，说明BC1-31的2条外源染色体与甘蓝型油菜C基因组的6号和1号染色体连锁群相对应； BC2-20对位于甘蓝型油菜C基因组的6号染色体连锁群的SSR引物（CB10010、CB10211）扩增结 果与甘蓝型油菜一致，而对位于

21、甘蓝型油菜 C基因组的1号染色体连锁群的SSR引物（CB10344、 BRAS002）的扩增结果与甘蓝型油菜不同，说明 BC2-20的外源染色体与甘蓝型油菜C基因组的6 号染色体连锁群相对应。图3 甘蓝型油菜C1和C6染色体连锁群特异引物的扩增结果1:甘蓝型油菜；2:大白菜；3: BC1-31 ; 4: BC2-20。Fig. 3 Amplification results of cabbage type rape C1 and C6 linkage group specific primers1: Cabbage type rape； 2： Chinese cabbage； 3： BC1-3

22、1 ； 4： BC2-20.3讨论前人的研究中大多是从BC1代分离群体中直接筛选单体异附加系（任艳蕊等，2010）,本研究中发现BC1代群体中单体异附加系出现的概率太低，筛选单体异附加系较为困难，而双单体异附加 系出现的概率很高，再从其后代中筛选单体异附加系则相对容易。附加外源染色体的鉴定有多种方法，如：形态学标记、染色体标记、分子标记等，其中染色体 标记和分子标记鉴定是较为简单和直观的。本研究中，对筛选出的2n + 1植株进行了核型分析，并与甘蓝型油菜的核型参数对比分析表明，附加染色体臂比值（2.63）与甘蓝型油菜C基因组6号染色体臂比值2.73 （Marina et al., 1998）相

23、接近；进一步的SS的子鉴定表明，该单体易附加系能够 扩增出甘蓝型油菜C基因组6号染色体的特异条带，将该2n + 1植株确定为大白菜一甘蓝型油菜C#园艺学报41卷基因组6号单体异附加系，暂时编号为AA + C6 。本试验中从附加了甘蓝型油菜C基因组6号和1号染色体的双单体异附加系自交后代中只筛选出了大白菜 甘蓝型油菜6号染色体单体异附加系，而没有得到1号染色体单体异附加系。分析其原因，一方面可能因为染色体的长度影响其传递率（张成合等，2008；吕文欣等，2011）；另一方面因为所用材料群体比较小，要想得到1号染色体单体异附加系还有待于扩大双单体异附加系回交后代群体规模。ReferencesGu

24、Ai-xia ， Zheng Bao-zhi ， Wang Yan-hua ， Xuan Shu-xin ， Luo Shuang-xia ， Shen Shu-xing. 2009. Obtaining and studies of Chinese cabbage monosomic alien addition line with chromosome 3 of cabbage. Acta Horticulturae Sinica , 36 (1) ： 39 W4. (in Chinese) 顾爱侠，郑宝智，王彦华，轩淑欣，罗双霞，申书兴. 2009. 附加甘蓝3号染色体的大白菜单体异附加

25、系的获得与研究. 园艺学报，36 (1)：39 W4.Heneen Waheeb K ， Geleta Mulatu ， Brismar Kerstin ， Xiong Zhi-yong ， Pires J Chris， Hasterok Robert ， Stoute Andrew I ， Scott Roderick J ， King Graham J, Kurup Smita. 2012. Seed colour loci , homoeology and linkage groups of the C genome chromosomes revealed inBrassica rap

26、aB. oleracea monosomic alien addition lines. Annals of Botany , 109： 1227 1242.Li Mao-xue ， Chen Rui-yang. 1985. A suggestion on the standardization of karyotype analysis in plants. Journal of Wuhan Botanical Research ， 3 (4) ： 297 T02. (in Chinese) 李懋学，陈瑞阳.1985.关于植物核型分析的标准化问题.武汉植物学研究，3 (4) : 297 T0

27、2.Liu Ai-hua ， Wang Jian-bo ， Zhu Ying-guo. 2003. RAPD analysis on the genome evolution of polyploids in Brassica . Acta Phytotaxonomica Sinica ，41 (6) : 520-530. (in Chinese)刘爱华，王建波，朱英国.2003.芸耋属多倍体植物基因组进化的RAPD分析.植物分类学报，41 (6) : 520巧30.Lu Wen-xin, Wang Yan-hua , Zhao Jian-jun , Gu Ai-xia , Li Yan-xi

28、a , Guan Zhi-kun , Wen Xiao-ying , Shen Shu-xing. 2011. Generation and identification of Chinese cabbage tabbage disomic alien addition line 1. Acta Horticulturae Sinica , 38 (7) : 1275 1282. (in Chinese) 吕文欣，王彦华，赵建军，顾爱侠，李艳霞，管志坤，闻晓英，申书兴. 2011. 大白菜 结球甘蓝1 号染色体二体异附加系的获得与鉴定.园艺学报，38 (7): 1275 1282.Marina

29、 Skarzhinskaya ， Jan Fahleson， Kristina Glimelius. 1998. Genome organization of Brassica napus and Lesquerella fendleri and analysis of their somatic hybrids using genomic in situ hybridization. Genome , 41 : 691 701.Piquemal J ， Cinquin E ， Couton F ， Rondeau C， Seignoret E ， Doucet I ， Perret D， V

30、illeger M J ， Vincourt P ， Blanchard P. 2005. Construction of an oilseed rape ( Brassica napus L.) genetic map with SSR markers. Theor Appl Genet , 111： 1514 1523.Ren Yan-rui ， Zhang Cheng-he ， Shen Er-qiao， Xuan Shu-xin ， Shen Shu-xing. 2010. Chromosome number identification and generation of monosomic alien addition line in the triploid interspecies hybrid of flowering Chinese cabbage Chinese kale. Horticulturae Sinica , 37 (2) : 213 N20. (in Chinese) 任艳蕊