马铃薯糖转运蛋白家族的全基因组鉴定和表达分析

1、    马铃薯糖转运蛋白家族的全基因组鉴定和表达分析    李晓川+周平+王朝海摘要：利用blastp程序在马铃薯全基因组中共鉴定出54个潜在的马铃薯糖转运子，分别属于7个糖类转运蛋白家族，分析这54个马铃薯糖转运子基因在不同组织器官、发育阶段、生物及非生物胁迫以及激素刺激下的表达水平与特性。该结果有助于加深对马铃薯糖转运子的了解，可为发现能提高马铃薯经济性的新基因奠定基础。关键词：马铃薯；糖转运子；基因组；系统进化关系；表达分析： s532.03文献标志码： a：1002-1302（2017）12-0024-03在植物中，碳水化合物被当作普遍的能量流通

2、媒介，在整体水平上糖类的运输被输导组织所控制，因此有了同化及储藏组织的概念1。典型的同化组织是光合作用活跃的组织，而储藏组织如果实、块茎等需要从同化组织转运光合作用产物才能发育。在大多数植物种类中首选蔗糖作为在韧皮部筛管中长距离运输的碳水化合物2。在细胞内，糖类同样在各细胞器之间运输，而液泡则充当了许多种碳水化合物的储藏器官3。从细胞膜或液泡膜转运糖，无论是主动运输还是被动扩散，都需要受到糖转运子的介导才得以维持在一个较高的速率上。尽管蔗糖转运蛋白家族（sucrose transporter，suc或sut）在馬铃薯中仅含有3个成员（在拟南芥中有9个成员），但是单糖的转运蛋白在拟南芥中共有53

3、个成员4，它们被划分成7个基因家族5，目前通常认为这7个基因家族分别为糖转运蛋白（sugar transporter protein，stp）家族、糖促进蛋白（sugar facilitator protein，sfp）家族、多元醇/单糖转运蛋白（polyol/monosaccharide transporter，pmt）家族、肌醇转运蛋白（inositol transporter，int）家族、质体葡萄糖转运蛋白（plastidic glucose translocator，pglct）家族、液泡单糖转运蛋白（tonoplast monosaccharide transporter，tmt）

4、家族、液泡葡萄糖转运蛋白（vacuolar glucose transporter，vgt）家族。尽管一些基因家族（如suc、stp）有非常全面的基因功能分析数据（如转运活力、表达水平、亚细胞定位以及转基因分析），但是对许多小基因家族的成员表征分析的报道非常少，尤其是在一些非模式物种中。马铃薯是全球第四大作物，同时也是粮菜兼用型作物，对马铃薯糖转运子基因在全基因组水平上的调查有利于提高对它的理解，从而有助于鉴定提高马铃薯经济性的新基因。根据马铃薯参考基因组6确定54个编码糖转运子的基因座，使用系统进化分析的方法，将所有糖转运子划分到已知的家族内，在每个家族内，将马铃薯与其他植物的糖转运子对比进

5、化关系。利用rna转录组的测序数据，分析糖转运子基因在不同组织器官、发育阶段、生物及非生物胁迫以及激素刺激下的表达水平。通过全面分析马铃薯糖转运基因家族，为马铃薯糖转运子的深入研究提供理论依据。1材料与方法1.1马铃薯糖转运子基因的鉴定马铃薯潜在的糖转运子，使用http：/上的blastp工具，以每个家族中在拟南芥及番茄中已鉴定的成员的蛋白序列作为查询序列，从马铃薯参考基因组6中鉴定出来。1.2预测亚细胞定位及跨膜螺旋结构域应用wolf psort程序预测糖转运子的亚细胞定位（http：/wolfpsort.seq.cbrc.jp）7。应用tmhmm server v. 2.0（http：/w

6、ww.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/）预测跨膜螺旋结构域8。1.3糖转运子rna测序数据分析利用马铃薯基因组测序协会（potato genome sequencing consortium，pgsc）的illumina rna测序数据分析糖转运子的表达模式7。数据库中的表达丰度用每百万个映射上的片段数中映射到外显子中的每1 000个碱基上的片段个数（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，fpkm）值表示。对组织器官及发育时期的热图（heat map）进行构建，fpkm值首先经过以2为底数

7、的对数进行转化。对于非生物胁迫及生物胁迫以及激素处理的热图进行构建时，首先计算与相应的对照的对比值。热图使用mev 4.9.0软件进行构建9。2结果与分析2.1马铃薯糖转运子成员及其同源蛋白的进化分析应用已鉴定的糖转运子的氨基酸序列，通过blastp程序检索马铃薯参考基因组，鉴定出54个编码全长糖转运子的基因座，结果如图1所示，通过进化分析将它们分成8个基因家族（蔗糖转运家族、糖转运子家族、糖促进蛋白家族、多元醇/单糖转运蛋白家族、肌醇转运蛋白家族、质体葡萄糖转运蛋白家族、液泡单糖转运蛋白家族、液泡葡萄糖转运蛋白家族）。同时，统计氨基酸数目并应用tmhmm server v. 2.0预测跨膜结

8、构域的数目，多数糖转运子拥有8个以上的跨膜结构域以及400个以上的氨基酸。糖转运子的亚细胞定位的预测结果显示，多数糖转运子定位在细胞膜及液泡膜上，此外，少数几个糖转运子预测定位在叶绿体及内质网上。在马铃薯中，3条氨基酸序列经鉴定属于蔗糖转运家族。蛋白质分别形成11个或12个跨膜蛋白结构域（tmd）。这与早期识别的3个马铃薯蔗糖转运蛋白10一致，而且没有发现更多的蔗糖转运蛋白家族的成员。糖转运蛋白家族（stp）在水稻中也被称为单糖转运子家族（monosaccharide transporter，mst），在葡萄中被称为己糖转运子家族（hexose transporter，ht），是马铃薯中糖转运

9、子最大的家族，有20个成员（图1），蛋白质预测定位在细胞膜或液泡膜中。在马铃薯基因组中，10个氨基酸序列经鉴定属于糖促进蛋白家族（sfp），也被称为类脱水初反应6家族（early response to dehydration 6-like，erd 6-like），蛋白质预测定位在细胞膜或液泡膜中。9个基因编码多元醇/单糖转运蛋白（pmt或plt）（图1），pmt的一般底物是糖醇如山梨糖醇或甘露糖醇，它在一些物种中取代蔗糖作为光合作用同化物的长距离运输形式，最著名的是果树蔷薇科11。在马铃薯基因组中，鉴定出3个潜在的编码h+/na+myo-肌醇转运蛋白或肌醇转运蛋白（int或irt）的基因座，

10、预测含有1012个跨膜结构域，含有496578个氨基酸分子（图1），int被认为参与h+和肌醇的协同运输。4个编码质体葡萄糖转运蛋白（pglct）的基因座在马铃薯基因组中找到，预测形成9个或10个跨膜的结构域，蛋白在亚细胞水平预测定位在叶绿体（stpglct1和stpglct2）或细胞膜（stpglct3和stpglct4）中（图1）。在马铃薯基因组中检测到3种液泡单糖转运蛋白（tmt），tmt在大多数物种中是氨基酸数量大于700的大蛋白，拥有1011个跨膜结构域（图1）。液泡葡萄糖转运蛋白（vgt）是糖转运子中成员最少的家族。在马铃薯基因组中鉴定出2个成员，分别是由503（stvgt1）、5

11、45（stvgt2）个氨基酸编码的蛋白质，预测定位在细胞膜和叶绿体中（图1）。endprint2.2糖轉运子基因的表达为确定糖转运子的组织特异性以及发育时期表达，利用pgsc在马铃薯不同器官和发育阶段以及在非生物胁迫处理、生物胁迫处理和激素刺激时的不同转录组经mrna测序所产生的转录组数据6，12，转录组测序数据经过随后的rna定量分析验证显示出很高的准确性12-13。pgsc的马铃薯rna-seq提供了在16种组织中超过 22 000 个马铃薯基因表达的转录组数据，代表了主要器官和发育阶段。54个糖转运子基因，其中44个在16个不同的发育阶段和器官检测到的转录水平的数据，而其余10个糖转运子

12、基因可能由于翻译水平太低而无法检测到，或者因为具有空间和时间表达特性而不包括在这个rna测序数据库中。在这44个糖转运子基因中有21个在所有的16种组织中都有表达，7个在15种组织中表达，4个在610种组织中表达，12个在1115种组织中表达。一些糖转运子基因表现出表达的组织特异性，如ststp4、ststp10、ststp12、stpmt8、stint3、stsfp7 均在花器官尤其是雄蕊中有表达。ststp1、ststp5在叶子和匍匐茎中表达量较高，ststp1的同源蛋白（slstp1、atstp1、vvht1）有己糖的运输活性。与atpmt1、atpmt2序列相近的stpmt4，在所有1

13、6种组织中都有较高的表达，而atpmt1、atpmt2被证明参与转运木糖醇和果糖10。stpglct1在成熟的果实中有高水平的表达，可能与它的同源蛋白一样参与到成熟果实中通过分解淀粉而得到的葡萄糖的转运。利用在非生物胁迫处理及生物胁迫处理时得到的转录组数据，对糖转运子基因进行表达谱分析。非生物胁迫处理（处理整株植物24 h）包括盐（150 mmol/l nacl）、甘露糖醇（260 mmol/l）、热胁迫（35 ）等，参加分析的数据为计算每个处理相对于对照的相对表达丰度。在非生物胁迫处理下，30个糖转运子基因在1个或1个以上胁迫条件下被诱导正表达，其中11个基因在所有的3种条件下在一定程度上均

14、被正诱导，15个基因在2种条件下在一定程度上均被正诱导，4个基因在1种条件下在一定程度上均被正诱导。而sttmt家族在这3种条件下表达水平均没有提升，而stsfp家族在盐胁迫下有8个成员表达均有提高，stsfp6在热胁迫下表达提高了10倍。stint2在盐和甘露糖醇胁迫下、stvgt2在盐和热胁迫下表达水平均有较大的提高。生物胁迫处理包括接种马铃薯晚疫病菌和2种化学诱导因子苯并噻二唑（bth，100 mg/ml）、dl-氨基丁酸（baba，2 mg/ml），以及利用离体受伤叶片模仿生物取食。参加分析的数据为计算每个处理相对于对照的相对表达丰度。在生物胁迫处理下，30个糖转运子分子在1个或1个以

15、上胁迫条件下被诱导正表达，其中2个基因（stvgt1和sttmt1）在所有的4种条件下在一定程度上都被正诱导；stvgt1和sttmt1在2种化学诱导因子下表达水平有较大提高。ststp5、stpmt7、stpglct4、stvgt2等4个基因在受伤叶片上表达水平有较大的提高，其中ststp5可能与参与生物胁迫时转运碳水化合物的vvht5为同源蛋白。为了鉴定激素应激糖转运子基因，利用激素刺激时得到的转录组数据分析整株植物经iaa（吲哚乙酸）10 mmol/l、6-ba （6-苄基腺嘌呤）10 mmol/l、ga3（赤霉酸）50 mmol/l、aba（脱落酸）50 mmol/l处理24 h后的相

16、对表达丰度。在激素刺激下，22个糖转运子基因在1个或1个以上胁迫条件下被诱导正表达，其中5个基因（stpmt2、stpmt6、stsfp1、stsfp2、stvgt2）发现在所有的4种条件下在一定程度上都被正诱导，stvgt2在6-ba处理后表达量提高11.8倍。3结论本研究在全基因组水平上全面分析了马铃薯糖转运基因家族，根据马铃薯参考基因组确定54个编码糖转运子的基因，通过比较基因组学利用不同物种的同源糖转运子了解马铃薯糖转运子的功能，对比54个糖转运子基因中的44个糖转运子基因在16种主要器官和发育阶段的组织中的表达情况，为下一步分析糖转运子的具体功能提供理论基础。参考文献：1bresin

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