Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制

1、    akt抑制剂mk-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制    熊琳 何晓琴 范黎 徐细明摘要 目的 探讨mk-2206作用于肝癌细胞huh7后对其生物学行为的影响及作用机制。 方法 体外培养人肝癌细胞系huh7，采用不同浓度（0、2.5、5、10、20、40 mol/l）mk-2206干预huh7细胞。采用cck-8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达。 结果 与对照组（0 mol/l）比较，mk-2206对肝癌细胞huh7的增殖活性有明显抑制作用，且呈剂量依赖性和时间依赖性（p <

2、0.05）;mk-2206诱导huh7细胞凋亡（p < 0.05），显著抑制akt的蛋白表达（p < 0.05）。 结论 akt抑制剂mk-2206可通过调控pi3k/akt信号通路来调控肝癌细胞huh7的生物学行为。关键词 肝癌;pi3k/akt信号通路;mk-2206;增殖;迁移;凋亡 r735.7          a          1673-7210（2019）01（a）-0008-05肝癌是世界第六大常见癌症，也是发生癌症相关死亡的第三大原因，近年来其发病率及死亡率仍呈

3、上升趋势1。我国肝癌患者人数占全世界肝癌患者的55%2。手术切除是肝癌的首选治疗方法，但肝癌发病隐匿，恶性程度高，进展速度快，根治性手术仅可用于不足30%的患者3。因此，系统性治疗在中晚期肝癌患者的治疗中扮演着重要角色。传统的化疗方法副作用大，疗效不佳，易耐药4。分子靶向药物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期，但其仅可延长总体生存期数月5-6。目前，迫切需要开发出新的靶向治疗药物。akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是pi3k/akt信号转导通路的重要靶点，该通路在调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及自噬等方面中具有重要作用7，有望成为新的恶性肿瘤治疗靶点。mk-2206是一种人工合成的akt特异

4、性变构抑制剂，可有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤活性8-9。本研究以肝癌细胞huh7为研究对象，探讨mk-2206的抗肝癌作用及其可能的作用机制，以期为其抗肿瘤研究和临床应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 仪器与试药1.1.1 仪器  超净工作台（美国airtech）;co2细胞培养箱（德国binder）;普通及倒置显微镜（日本olympus）;离心机（德国thermo）;流式细胞仪（美国bio-rad）;酶标仪（美国perkin elmer）;超低温冰箱（new brunswick scientific）、电热恒温干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）;s

5、ds-page电泳（北京六一生物科技有限公司）;odyssey双色红外激光成像系统（美国li-cor）等。1.1.2 试剂  dmem（美国gibco公司）;胎牛血清（美国gibco公司）;青链霉素（美国hyclone）;胰蛋白酶-edta（美国hyclone）;胰蛋白酶（美国hyclone），mk-2206（selleck公司）;cck-8试剂（日本dojindo）;细胞凋亡试剂盒（美国bio-rad）;bca蛋白定量试剂盒（美国sigma）;蛋白上样缓冲液（日本takara）;蛋白marker（日本takara）;蛋白抗体（美国abcam）等。1.1.3 细胞系  人肝

6、癌细胞huh7细胞购自上海中国科学院细胞库。1.2 方法1.2.1细胞培养与传代  将huh7细胞接种于含10%灭活胎牛血清的dmem培养液中，在37、5%co2、饱和湿度下培养，每2 d为细胞更换培养液1次。于显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长到覆盖瓶底70%80%面积时，可进行传代接种。弃瓶内的培养基，用1 ml胰酶均匀覆盖瓶底，在培养箱孵育12 min，待細胞收缩变圆，用培养基终止消化，离心，弃上清，按13传代，用于后续实验。1.2.2 cck-8细胞生长抑制率检测  取对数生长期的huh7细胞，0.5%胰酶消化1 min后，rt 1000 g/min离心5 min

7、，重悬培养基，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于3块96孔板，每孔加入上述细胞悬液100 l。待细胞贴壁后加入mk-2206，使药物终浓度分别为2.5、5、10、20和40 mol/l，每种浓度组以及阴性对照组均设5个复孔。分别在加药后24、48、72 h后加入cck-8（10 mg/ml）10 l，于37培养箱孵育30 min1 h，以490 nm为检测波长，用酶标仪读取吸光度，取5个复孔的平均值。上述实验重复3次。抑制率=1-（od加药孔-od调零孔）/（od对照孔-od调零孔）。1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率  收集不同药物浓度（0、2.5、5、10、20和

8、40 mol/l）处理24 h后的huh7细胞，收集原培养基，用0.5%不含edta的胰蛋白酶0.5 ml消化各孔，30 s1 min后终止消化，将原培养基和消化液一同离心，rf 2000 g/min离心5 min。其后，弃上清，用2 ml 4预冷磷酸盐缓冲液（pbs）悬浮细胞，2000 g/min，离心5 min。重复上述步骤一次，弃pbs，加入100 l binding buffer，加入5 l异硫氰酸荧光素（fitc），涡旋混匀后，加入10 l碘化丙啶（pi），室温避光孵育5 min，再补充加入400 l binding buffer后上机检测。上述实验重复3次。细胞总凋亡率=早期凋亡率

9、（annexin+/pi-）+晚期凋亡率（annexin+/pi+）。1.2.4 western blot测蛋白表达量差异  取对数生长期huh7细胞，接种于6孔板，待细胞贴壁24 h后，用不同药物浓度（0、2.5、5、10、20和40 mol /l）处理24 h。加入 4预冷的细胞裂解缓冲液100 l后，冰上作用30 min。用细胞刮刀刮取细胞碎片和裂解产物，移入1.5 ml离心管。用超声波细胞粉碎机粉碎上述产物后，4 12 000 g/min高速冷冻离心20 min。bca检测法检测蛋白浓度，用细胞裂解缓冲液调整各组间的蛋白浓度，使其一致，加入上样缓冲液，100加热5 min。十

10、二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sds-page）凝胶电泳，将分离后蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯（pvdf）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜3次后分别加入一抗（akt、p-akt、-catenin及gapdh）4摇床过夜孵育12 h，而后洗膜3次，加入二抗于摇床作用1 h，再次洗膜3次，于odyssey上扫膜，并计算灰度值。上述实验重复3次。相对灰度值=目的蛋白灰度值/内参灰度值。1.3 统计学方法应用spss 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，等级资料比较用秩和检验;计数资料用率表示，组间比较采用成组2检验，多组间比较采

11、用方差分析，以p < 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 mk-2206对huh7的生长抑制作用cck-8实验结果表明，不同浓度mk-2206处理huh7细胞24、48、72 h后均能抑制细胞生长增殖，且抑制效应呈时间和浓度依赖性。mk-2206的24、48、72 h的半抑制浓度（ic50）分别为5.467、2.961、1.924 mol/l。当药物浓度达到40 mol/l时，在不同药物作用时间下均可使huh7几乎全数死亡。见图1。2.2 mk-2206对细胞凋亡的影响取mk-2206浓度0、2.5、5、10、20和40 mol/l，作用huh7细胞24 h后，利用流式细胞仪检测

12、各组细胞凋亡情况。结果显示，除外2.5 mol/l，与空白对照组（0 mol/l）比较，其余各浓度组的凋亡率明显升高，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（p < 0.05）。见图2、表1。当药物浓度达到40 mol/l时，镜下观察，huh7细胞几乎全数死亡，流式图中呈现单一细胞团。其后增设浓度组，即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 mol/l作用于huh7细胞24 h后检测细胞凋亡情况。结果当药物浓度达到30 mol/l，即出现huh7细胞大量凋亡。见图2a。2.3 mk-2206对akt/pi3k/mtor信号通路的影响药物浓度达40 mol/l时，huh7细胞出现大

13、量凋亡，其提取所得蛋白的浓度过低，无法显示出蛋白条带。western blot结果显示，与空白对照组（0 mol/l）比较，akt蛋白表达水平随mk-2206的浓度升高而显著降低，差异有统计学意义（p < 0.05）;与空白对照组比较，p-akt蛋白水平表达无明显变化，差异无统计学意义（p > 0.05）。见图3。3 讨论肝癌的发生率及死亡率呈上升趋势，是我国沉重的经济负担。目前的治疗方式使患者获益有限，急需探索新的治疗方式10。pi3k/akt在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的恶性进展，同时在肝癌恶性进展及化疗耐药中起到重要的作用11-12。akt作为pi3k的下游靶蛋白，是pi3k

14、/akt信号通路的核心靶点。因此，通过调控akt表达可调整细胞增殖和凋亡的平衡，进而抑制肿瘤生长13。mk-2206可促进急性髓性白血病细胞的凋亡，并且增加阿糖胞苷的细胞毒性14。mk-2206可通过抑制mapk信号通路抑制胃癌细胞生长15。同时，mk-2206也抑制结肠癌肿瘤干细胞的增殖16。在临床研究中，mk-2206也展示出了良好的治疗效果17-19。本研究發现，mk-2206可以抑制huh7细胞的增殖，且抑制效应呈浓度和时间依赖性;mk-2206可以促进huh7细胞的凋亡，且呈浓度依赖性。mk-2206可通过抑制huh7中的pi3k/akt信号通路来发挥抗肿瘤作用。本研究的不足之处：实

15、验对象单一，缺乏体外实验，后期可以对具有高侵袭能力的肝癌细胞系开展相关研究;本研究只对pi3k/akt信号通路上的关键蛋白进行了蛋白表达水平的验证，缺乏对这两条通路的下游靶蛋白表达水平的验证;本研究缺少凋亡相关蛋白的表达水平的验证。综上所述，研究发现akt抑制剂mk-2206通过抑制pi3k/akt信号通路促进肝癌细胞系huh7的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。后期可进一步完善mk-2206对肝癌细胞抗肿瘤作用的研究。参考文献1  forner a，llovet jm，bruix j. hepatocellular carcinoma j. lancet，2012，379（9822

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