非小细胞肺癌中miR-181a-5p功能的研究

1、miR-181a-5p在非小细胞肺癌中的功能研究 摘 要 目的 探索miR-181a-5p 的抑癌机制，并探讨它作为标志物用于检测肺癌细胞的可行性。方法：采用CCK8（Cell Counting Kit-8）方法和流式细胞术分别检测细胞增殖情况和细胞凋亡情况; 蛋白质印迹技术检测miR-181a-5p对靶蛋白表达的影响； 细胞划痕和Transwell实验检测miR-181a-5p对细胞株的运动抑制；利用双荧光报告基因实验对靶基因进行验证。结果：结果显示miR-181a-5p抑制可A549细胞株的增殖，并且促进细胞的早期凋亡；A549细胞的运动受到miR-181a-5p显著的抑制；miR-181

2、a-5p 直接作用于靶基因的3UTR行使调控。结论： miR-181a-5p可显著抑制NSCLC (non-small cell lung cancer) 细胞生物进程，发挥抑癌基因的作用。关键词 miR-181a-5p；增殖；迁移；凋亡；非小细胞肺癌 中图分类号 文献标识码Analysis of miR-181a-5p function in Non- small cell lung cancer Abstract Objective The aims of this study were to explore the biologic functions in NSCLC of miR-1

3、81a-5p and to investigate whether it can be a marker for detecting NSCLC. Methods 1.To examine the cell growth and apoptosis, CCK8 and flow cytometry were applied ,respectively. 2. To determine the expression effects of miR-181a-5p, western blot blot was used.3. Transwell assay and wound healing ass

4、ay. 4. Plasmid constructs and luciferase reporter assay.Results 1. miR-181a-5p inhibited cell proliferation and promoted cell apoptosis in vitro.2. Transwell assay and wound healing assay showed that miR-181-5p negatively regulated cell migration in vitro.3. miR-181a-5p down-regulated Kras expressio

5、n by directly targeting its 3-UTR 5. Kras is inversely correlated with miR-181a-5p expression in NSCLC. Conclusion miR-181a-5p might provide a potential treatment approach for NSCLC patients. Keywords miR-181a-5p;Proliferation；migration; apoptosis; non small cell lung cancer恶性肿瘤为全球较大的

6、公共卫生问题之一，给人类的身心健康带来了极大的危害，并将在新世纪成为威胁人类生命的第一大杀手1-2。在肿瘤的发生发展过程中，miRNA通过调控基因表达影响细胞功能，起抑癌或促癌作用。起抑癌作用的miRNA主要通过调控功基因来抑制细胞的增殖、迁移或促进细胞的凋亡来抑制肿瘤的发生3-41 材料与方法 1.1 实验材料 非小细胞肺癌细胞株SPCA-1 购自ATCC；非小细胞肺癌细胞株A549 购自中科院生化细胞所细胞库。 1.3 实验方法 （1）细胞培养：非小细胞肺癌细胞株A549、SPCA-1分别培养在含有10%胎牛血清、青霉素105IU/L、链霉素100mg/L的1640和DMEM培养基中，培养

7、基于37，CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养。细胞融合到85%左右时，用0.25%胰酶消化，传代9。（2）细胞增殖实验5：取对数生长期的细胞，以1×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔接种100L，培养待细胞贴壁后，再分别加入miR-181a-5p、anti-miR-181a-5p，每组设置6个复孔，同时设置不受处理因素的对照组（NC），也设置6个复孔。分别培养24h和48h后，每孔加入25L的MTT噻唑蓝，继续培养4h后小心弃去培养液，再每孔加入150L的DMSO，于摇床上振摇10min，充分溶解生成的结晶，然后于490nm波长处测定各组的光吸收值（OD值），重复3次

8、，取均值。用下面的公式计算各组药物的细胞的抑制率10-11：抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100（3）流式细胞仪检测6 按照流式细胞仪检测细胞凋亡试剂盒操作，以适量的胰酶消化、收集转染后的A549细胞，磷酸盐缓冲液洗涤、重悬细胞，2000r/min5min收集（1×105）-（5×105）个细胞，离心沉淀，加入500ulBinding Buffer重悬细胞，向重悬液中加入5ul Annexin V-FITC染色，随后加入5ulPI染色，室温下避光孵育15min，流式细胞仪检测凋亡率，实验重复3次。（4）miR-181a-5p靶基因的鉴定7从A549细

9、胞中提取总RNA，并反转成cDNA后用来作为PCR的模板，成功的得到了5种靶基因的目的片段。经割胶回收后，在37用相适应的限制性内切酶酶切2 h后，用T4 DNA连接酶16连接过夜后，转化TOP10大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆经扩大培养后，提取质粒，送至上海英俊生物公司测序。经序列比对无误后，用无内毒素质粒大抽试剂盒提取重组质粒。抽得重组质粒，用限制性内切酶酶切验证.。（5）细胞运动实验 8-9在显微镜载物台上静置细胞2.5h，通过摄像头、监控仪、录像机等设备记录真个过程，然后通过图像转化和采集系统保存实验照片。用Imagine Tool和Image-Pro Plus 6.0测量每个时间点内

10、稀薄啊的几何中心二维坐标，用Microsoft Excel 2013XY散点兔绘制细胞迁移轨迹，时间间隔为5min,每张图去5个细胞求平均数。（5）qRT-PCR分析基因转染miR-181a-5p下调：在 A549 细胞中做做转染，对照组转染 NC，实验组转染miR-181a-5p ，在 mRNA 水平检测 miR-181a-5p 对靶基因的下调情况，靶基因里除了预测的基因，还包括文献中已经报道 miR-181a-5p 明确的靶基因，如BCL2L11，但这些基因在非小细胞肺癌中并未验证，而是在其它癌症中做过相关研究，引物来源于哈弗医学院的引物库 (http:/pga.mgh.harvard.e

11、du/primerbank/)。1.2 实验仪器 仪器 型号 厂家主要仪器有FLx8酶标仪（BIO-RAD），C1000TMThermal Cycler PCR仪（BIO-RAD）， TGL-18000-CR高速台式离心机（上海安亭科学仪器制造有限公司） SW-CJ-2F超净工作台（苏静安泰有限公司） SW-CJ-2F多功能脱色摇床（上海智成分析仪器制造有限公司） XW-80A漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）JY92-11超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司） PK-SZZ电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司） PL203电子分析天平（METTLER TOLEDO 上海有

12、限公司） CFX96qRT-PCR仪（BIO-RAD） LRH-250F CO2恒温培养箱（SHELLAB） MLS-3708高压灭菌锅（SANYO） 2 结果 2.1 miR-181a-5p抑制细胞增殖和克隆形成 细胞克隆实验结果显示，上调miR-181a-5p会显著抑制细胞株A549的增殖（图1A），细胞用结晶紫染料染色。通过qRT-PCR检测细胞转染效率，发现miR-181a-5p将近上调了40倍（图1 B）。细胞转染 miR-181a-5p后增殖能力低于转染NC的对照组，而转染anti-miR-181a-5p的实验组对比NC增殖能力有所提升（图1C）。软琼脂实验中，对比NC，过表达mi

13、R-181a-5p 抑制了细胞克隆的形成，细胞克隆的数量和大小均有显著的差异（图1E，F），这几个实验证明了过表达miR-181a-5p对A549细胞增殖具有抑制作用。图1 miR-181a-5p对A549细胞增殖的影响Fig.1 MiR - 181 - a - 5 p's influence on the proliferation of A549 cells2.2 miR-181a-5p对细胞凋亡的影响 流式结果表明，实验组在转染miR-181a-5p 48h后早期凋亡提高了6.37%（见图2）。为了阐明机制，在蛋白水平进一步分析了caspase-7的表达量，发现转染miR-181

14、a-5p的实验组 caspase-7 的蛋白水平有所升高。这些结果说明了 miR-181a-5p 的上调促进了细胞的早期凋亡。图2 miR-181a-5p 对A549细胞凋亡的影响Fig.2 MiR - 181 - a - 5 p effects on apoptosis of A549 cells2.3 过表达miR-181a-5p对A549细胞的运动和迁移的影响 细胞划痕法结果表明细胞转染miR-181a-5p后细胞迁移率显著降低，只有大约18%，而细胞转染anti-miR-181a-5p后具有较高的运动水平，细胞迁移率接近45%（图3A、3C）。 Transwell实验结果显示与对照组N

15、C相对比，实验组穿过Transwell小皿的细胞数量在转染miR-181a-5p后显著减少，约为75个细胞（图3B、3D）。表明转染miR-181a-5p的A549细胞的迁移受到了显著的抑制。图3 miR-181a-5p 对A549细胞运动的影响Fig.3 On the movements of A549 cells2.4 miR-181a-5p靶基因的鉴定 2.4.1 PCR产物连接载体 载体酶切位点信息（见图4），酶切后对比片段大小。图4 PGL3载体上酶切位点及相关信息Fig.4 PGL3 vector restriction sites and related information2

16、.4.2双荧光报告基因分析 重组载体与miR-181a-5p的mimics共转染HEK-293T细胞48 h后，分别检测各组海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性，以转入NC和重组质粒的作为对照组。结果表明5种靶基因的3-UTR均受到了miR-181a-5p的调控，其中以Kras和PLAG1受到的调控最为明显，相比转入NC的对照组显著下降了50% 左右，其中的Kras因为在3-UTR发现2个结合位点，因此在克隆Kras时共克隆了3个载体，第一个载体含有miR-181a-5p的第一个结合位点，第二个载体上的片段含miR-181a-5p 的另一个结合位点，第三个载体连上的片段包含有miR-181a-5

17、p结合的2个位点（图5）。从结果可以看出这些基因的3-UTR受到miR-181a-5p的调控，而Kras基因的2个位点都有不同程度的下调，同时包含有2个结合位点的载体比其中任何一个都较为明显，推测这2个结合位点都是有效的。图5 miR-181a-5p与其可能的靶基因的荧光实验结果Fig.5 The fluorescence experiments target gene miR-181a-5p and its possible.注：与正常对照组相比，miR-181a-5p，*P0.05;* P0.01;*, P0.00(图6、7同)2.4.3 qRT-PCR分析基因转染miR-181a-5p下

18、调情况 本实验结果显示在这些靶基因中Kras的mRNA下调情况最为显著（图6 A），而原先在乳腺癌中报道的 BCL2L11 为 miR-181a-5p 的靶基因，在非小细胞肺癌中得到相反的结果，靶基因在mRNA水平反而上调了。因此，推测miR-181a-5p 或BCL2L11 所扮演的角色具有组织或者细胞特异性。即不同的基因在不同的组织或细胞中调控的通路或者网络存在差异性。 对照组转染NC，结果显示，和对照组相比，实验组的许多抑癌基因表达量有所上调，一些促进凋亡的基因表达量相对升高如（图6 B）；miR-379，miR-30a，miR-126-3p，有显著的下调，而在其它癌症中比较明确发挥抑癌

19、功能的miR-34a的表达量显著上调，这进一步证明了miR-181a-5p调控网络的复杂性，以及在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的功能。图6 miR-181a-5p 过表达后对基因的mRNA水平的调控情况Fig.6 The fluorescence experiments target gene miR-181a-5p and its possible.2.4.4 miR-181a-5p靶基因的验证 为了验证miR-181a-5p可以直接作用于Kras的3-UTR，调控其在mRNA和蛋白水平的表达，并明确结合位点，实验已构建好的PGL3载体为模版，做载体突变实验，将载体上的miR-181a-5p的

20、结合位点TGAATGT突变成CGGACGC如（图7 A）所示，突变后的位点经转录后将不能和miR-181a-5p结合。突变采用传统的引物隔花突变，隔一个碱基做一个突变，突变采用高保真酶进行，PCR后的产物因为有原来大抽的载体，即实验中作为模版的载体和PCR的突变产物载体，因此需要去除原来未突变的载体。大抽的载体因为在菌体里有经过甲基化，而PCR的突变载体没有甲基化，所以我们可以在整个产物中加入甲基化酶来破坏原有的模版载体，再进行转化和测序，并进行荧光实验验证，结果如（图7 B）所示。 然而，内源的Kras在蛋白水平是否受到miR-181a-5p的调控？如（图7 C）所示，转染miR-181a-

21、5p的实验组Kras的蛋白水平下调了将近75%，而转染anti-miR-181a-5p的实验组和NC相比也有显著的区别。因此，本实验证明了miR-181a-5p可以在mRNA和蛋白水平对靶基因Kras进行调控。图7 miR-181a-5p 通过靶向结合3-UTR下调Kras的表达Fig.7 Expression of miR-181a-5p in Kras to combine 3 '-UTR through the target2.4.5 DNA甲基化影响的初步研究 DNA甲基化是一种表观遗传修饰，在甲基转移酶的催化下，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基, 选择性地添加甲基到DNA的CG两个核

22、苷酸，形成5-甲基胞嘧啶。基因的启动子区CpG岛在正常情况下一般是非甲基化的，当发生甲基化时，时常发生基因的转录沉寂，使一些抑癌基因丧失功能，从而导致正常的细胞调控失常，与肿瘤的发生，发展密切相关。本实验为了探索甲基化对miR-181a-5p表达的影响，用甲基化酶抑制剂处理A549细胞并做相关检测。结果显示如（图8）所示：甲基化酶抑制剂处理完的细胞miR-181a-5p的转录水平显著提升，推测未加甲基化酶抑制剂的对照组受到甲基化酶的调控，影响miR-181a-5p的表达，而Kras作为miR-181a-5p靶向调控的基因，在miR-181a-5p表达水平上升时发生下调也是合理的。图8 加入甲基

23、化酶抑制剂后miR-181a-5p和Kras的表达Fig.8补充英文表题。 Expression of miR-181a-5p and Kras to join the methylation enzyme inhibitor3 讨论本研究证明了miR-181a-5p和Kras存在负相关的关系，miR-181a-5p在A549细胞株中发挥抑癌基因的功能，在病例样本中，病人的年龄以及癌症的恶性程度越高，相应的miR-181a-5p表达量比较低。而Kras则随年龄和恶性程度的升高而表达量上升。细胞株中miR-181a-5p的表达量普遍显著下调。之前报道的乳腺癌中miR-181a可以下调BCL2L1

24、1并发挥抑癌基因的功能，但在A549中过表达miR-181a-5p后BCL2L11却出现上升的情况，因此推测基因具有组织或细胞特异性10-12。细胞癌化到一定阶段往往具有迁移性，从而导致肿瘤的扩散。起抑癌作用的miRNA 可能通过调控一些基因，影响细胞的迁移，细胞迁移也是癌症进程的一项重要指标。本实验运用两种相类似的方法共同验证miR-181a-5p对细胞迁移的影响13-14。此外，miR-181a-5p对其它miRNA也有调控作用，miR-34a在转染miR-181a-5p后有显著的上调15。通过这些实验暗示了miR-181a-5p在非小细胞肺癌中能影响多样的细胞进程，通过靶向基因调控发挥作

25、用。肿瘤的治疗还需要解决一些技术问题，需要选择合适的给药载体和给药方式使药物可以准确地送达病灶。除了技术问题我们还应顺着调控网络追溯到源头，鉴定miRNA的启动子及转录调控因子，相信随着新技术的不断发展，这些机制将会向我们揭开神秘面纱，使miRNA应用到各类疾病的应用和治疗中。参考文献1 Rana TMIlluminating the silence: understanding the structure and function of smalRNAs J. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(1): 23-29. 2 Ahn HW, Morin RD, Zhao

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