东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建

1、东北白桦COMT基因克隆及其植物表达载体构建1 367 bp （GenBank登录号：KC292201），其中完整编码区 长度 1 095 bp ，编码 365 个氨基酸。利用 Gateway 技术分别构 建了东北白桦COMT植物过量表达和反义表达载体。木质素（ Lignin ）是酚类多聚体，其在植物体内的含量仅次 于纤维素 1 ， 2 。因聚合前单体（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不 同，木质素可分为紫丁香基木质素（ S 型木质素）、愈创木基木 质素（G型木质素）和对-羟基苯基木质素（H型木质素）3种。 裸子植物木质素主要为 G型，双子叶植物主要含 G型和S型木质 素，单子叶植物则含 G型、S型和

2、H型木质素 。木质素的生 物合成分为 3 个阶段： 光合同化产物形成苯丙氨酸， 苯丙氨酸代 谢生成木质素单体以及单体聚合形成不同类型的木质素。 木质素 单体合成途径中存在多种代谢关键酶类，如苯丙氨酸氨解酶（Phe nylala nine ammo nia-lyase ， PAL），阿魏酸-5-羟基化酶 （Ferulate 5-hydroxylase ， F5H，咖啡酸 /5-羟基阿魏酸-O- 甲基转移酶（ Caffeic acid-O-methyltransferase ， COMT ，咖 啡酰辅酶-A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAO

3、MT和肉桂酰 CoA还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase ，CCR等，该途径也是目前 木质素调控研究的重点4，5。COM催化咖啡酸、5-羟基松柏 醛和 5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，参与S型木质素的合成，裸子植物中COM只催化咖啡酸 。研 究表明COM是 S型木质素合成中的关键酶，而且与G型木质素向S型木质素的转化密切相关7。此外，拟南芥comt突变体更 容易被细菌和真菌所感染8，反义抑制COMT与 CCoAOM表达 均使转基因烟草植株木质素含量下降， 且两个基因同时被抑制时 下降辐度更大 9， 10。东北白桦(Betula platyphylla )是

4、耐寒、喜光、耐贫瘠的 树种，具有生长快、适应性强和用途广泛等特点，是我国北方重 要树种之一 11 。然而东北白桦木材存在材性脆、 韧性弱和密度 较低等问题， 对东北白桦材质材性进行遗传改良是目前研究的热 点。本研究克隆东北白桦 COMT基因全长序列，构建东北白桦 COMT基因植物过量表达和反义表达载体，以期为东北白桦材质 材性的遗传改良奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1 菌株与质粒 pENTR/SD/D-TOP仿口 TOP10感受态细胞 购自 Invitrogen 公司，pMD18-T载体购自 TaKaRa公司，pGWB2 载体、DH5况和农杆菌感受态为东北林业大学林木遗传育种国家 重

5、点实验室自制。1.1.2 植物材料 3 个月苗龄的东北白桦苗种植于东北林业大学实验林场，采集幼嫩叶片用于植物总RNA的提取。1.1.3 主要试剂pBIOZOL购自博日科技 XX公司，LA-Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTR RNA LA PCRTM Kit反转录试剂盒 及 3 -Full Race Kit购于 TaKaRa公司，Silica Bead DNA GelExtraction Kit 购自 Fermentas 公司，质粒小提试剂盒购于 Promega公司，Gateway LR Cionase II Enzyme Mix 购自 Invitrogen 公司，卡那霉素、潮

6、霉素、庆大霉素、利福平购自 Sigma 公司。1.2 方法1.2.1 东北白桦总 RNA的提取及cDNA的合成将东北白桦材料在液氮中研磨至粉末，用小勺取0.1 g粉末至离心管中，采用pBIOZOL提取总RNA具体操作步骤详见其说 明书，得到的总RNA用适量的无RNase水溶解，采用紫外分光光 度计测定RNA浓度与纯度。用 RNA LA PCRTM Kit反转录合成第 一链cDNA具体操作参照试剂盒说明书进行。1.2.2东北白桦COMTE义和反义片段的克隆TGGTG-），以东北白桦总 cDNA作模板，PCF扩增出东北 白桦COMT序列核心片段。采用 cDNA末端快速扩增（Rapid Amplip

7、hication of cDNA Ends, RACE 获取 COMT全长序列，3 RACE扩增引物为 D1, 5 -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT- D2, 5 -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTT具体操作按 3 -Full Race Kit 说明书进行。TTCCATGAT-。PCR扩增反应体系为：2.0 卩 L 10X Buffer、 上下游引物各 0.5卩L、2.0卩L dNTPs 1.0卩L模板、0.5卩LTaq酶、13.5 卩 L H2Q PCR反应程序为：95 °C 5 min； 95C 30 s, 60 C 30 s , 72 C 30 s

8、, 30 个循环；72 C 7 min。PCR产 物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，采用 Silica Bead DNA Gel Extraction Kit 回收、纯化目的片段，连接 pMD18-T载体，经 验证为阳性后送上海英骏生物技术XX公司测序。1.2.3pGWB植物表达载体的构建植物表达载体构建采用 Gateway技 术，将PCF扩增得到的COMTE义和反义片段回收纯化后插入 pENTR/SD/D-TOP入门载体。经 DNA测序正确的质粒与 pGWB采 用 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 进行 LR反应，反应产物 转化大肠杆菌DH5x感受态细胞，对

9、阳性克隆进行鉴定筛选。1.2.4生物信息学分析用DNASTA软件预测基因最长开放 阅读框及氨基酸序列，通过BLAST程序分析东北白桦与数据库中 已知物种的COMT序列的同源性，用 ClustalX 软件分析氨基酸 序列一致性。2 结果与分析2.1东北白桦COMT完整编码区cDNA序列的克隆比对陆地棉、毛果杨、赤桉和欧洲白桦COM基因同源序列的保守区后设计一对简并引物（U1, U2）,经PCRT增得到东北 白桦COMT保守区核心DNA片段。进一步进行东北白桦 COMT的 3 RACET增，获得含3端的东北白桦 COMT序列852 bp。经 BLAST同源性比对表明，克隆得到的东北白桦 COMT基

10、因序列与 欧洲白桦COM核酸相似度为99.5%。以报道的欧洲白桦 COM基 因起始编码区序列为上游引物， 克隆得到的东北白桦 COMT基因 终止编码区为下游引物，PCR扩增得到长度约为1.1 kb的特异 条带（图1），回收目的片段后测序，结果表明该序列长度为1 095 bp。加上该COMT的 3端序列，克隆得到的东北白桦 COMTCDNA 序列全长为1 367 bp，将其上传到Gen Ba nk数据库中，登录号 为 KC292201。2.2东北白桦COMT完整编码区cDNA序列分析东北白桦COMT开放读码框（Open reading frame ）长度为 1 095 bp （图 2），编码 3

11、65个氨基酸（图 3），同源性比对结 果显示东北白桦 COMT序列与陆地棉COMRFJ479708）、毛果 杨 COMTEU889124、赤桉 COMTGU324973 以及欧洲白桦 COMT（FJ667539.2 ）的同源性分别为 79.2%、79.2%、77.2%和 99.5%。2.3东北白桦COMT植物表达载体的构建用P1、P2引物扩增 COMT编码区并将其与 pENTR/SD/D-TOPO 入门载体连接，得到重组质粒 pENTR/SD/D-TOPO-COM,T利用LR 反应将该入门载体插入的 COMT片段交换到pGWB植物过量表达 载体上，得到pGWB2-COM植物过量表达载体。同理获

12、得 COMT1 反义植物表达载体 pGWB2-antiCOMT（1 图 4）。将构建的重组质 粒导入农杆菌，获得其工程菌分别用于今后白桦COMT基因过量表达和降低表达的转基因实验。3小结与讨论白桦是东北地区重要的造林树种，由于东北白桦木材材性脆、韧性和密度较弱， 通过基因工程手段调控木质素代谢途径是 改良东北白桦材质与材性的有效途径之一 12 。近几年白桦基因 工程相关研究零星地出现在一些报道中， 如白桦果胶甲酯酶抑制 剂（PMED可调节细胞壁的结构变化，实现对细胞生长的调控 13;白桦苯丙氨酸解氨酶（PAL对于其抵抗病原菌过程起着 重要作用，并且其酶活力与抗病性正相关 14 ；刘雪梅等 15 分离了白桦木质素生物合成相关酶 CCoAOM和4CL基因，并将其 转入烟草探讨其