几种菌种的保存及复苏方法

1、几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培 养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于46 'C进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、 包装、灭菌后使用。1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。1.3 调 pH 值配料溶解后将培养基冷却至室

2、温，根据要求加稀酸 （ 0.1mol/L 盐酸）或稀碱 （10% 氢氧化钠 ）调 pH 值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一 （45mL），穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免 弄湿棉塞造成污染。1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基

3、名称及配制日期。1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121 C，1520min。1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30 C培养13天。无菌检查合格后将其保存于4 C下备用。2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划 “之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波

4、状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密 “之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。2.2 穿刺接种用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管 底），然后沿原穿刺途径慢慢抽岀接种针。适用于细菌和酵母菌等。2.3液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。3培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟抱子。细菌培养温度 一般为3037'C,真菌培养温度一般为 2528Co

5、4保藏培养好的菌种于46C保存，根据要求每 36个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵 母，棉病囊霉等，须13个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%70% o斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。液体石蜡保藏法亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下 培养至菌种长岀健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46 C）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤如下：1液体石蜡的准备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：121 C湿热

6、灭菌30min，置40C恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。160 C干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。2斜面培养物的制备参照定期移植法。3灌注石蜡将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。4保藏4.1 注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（46C）干燥处保藏，保藏时间 210年。4.2 保藏期间应定期检查，如培养基露岀液面，应及时补充无菌的液体石蜡。 5恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管

7、、75%酒精及75%酒精棉球Q Q拉圭苴3.2 培养基改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮用于白色念珠菌复苏、复壮 液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、 短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。3.3操作步骤：a. 打开洁净工作台。b. 在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。C.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安 瓿遇热时可能会破裂） 。d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.50.8 ml到安瓿中。e轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种

8、和液体培养基充分混合并完全溶解。f. 用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。g. 根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度3035C,培养1824小时；真菌培养温度 2328C,培养35天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复 苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，若仍未浑 浊，灭菌处理。h. 黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置 2328C培养57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均 一，不应有杂色， 斜面侧面无色， 接近菌层培养基略带黄色。 确认后用含有

9、 0.05%（ ml/ml ） 的吐温 -80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。i. 取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml至液体培养基中按 g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备 10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余 作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。 以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控

10、制，即进行相应的确认。其 余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编 号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j 储备菌种管制备成功，储存于20 C，有效期为三年。3.4菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在3035C下培养23天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在2328 C下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。3.5 污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长， 则说明或操作有污染或菌种不纯。 将此被污染了的培 养物灭

11、菌处理。 可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管3.6 菌种的传代与保藏将菌种接种至一新鲜培养基上， 每萌发一次即称为一代， 因此， 当原始菌种复溶并转至新培 养基内生长， 即认为已传代一次， 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第 0代，冷冻干 燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第 3代为工作菌种。 菌种的传代次数 （自原始菌 种冻干粉起）不得超过 5 代。菌种的传代保藏过程3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第 3 代。工作用菌种，分为两类：一 类用于

12、定期传代（W3），类用于实验用（S3）。定期传代用菌的传代其操作步骤如下(斜面接种法) ：(1) 从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30 分钟。(2) 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移 入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。(3) 关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒 后端，将接种环烧红约 30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。(4) 右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔 开管塞， 将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下， 稍冷后再至菌苔上， 刮

13、取少量菌 苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。(5) 塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面(或改良马丁琼脂斜面)一支，照上 述操作打开管塞， 将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线， 然后从底部向上作 连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。(6) 取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上 烧灼灭菌。(7) 将已接种好的细菌管置3035C细菌培养箱培养 2224h，真菌管置2328C真菌培养箱最多培养 7 天。当工作用菌种传代代数小于 5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：(W3)可直接转接为(W4)

14、。按上述程序操作，直至( W4)转为(W5)为止，需重新接 种，旧的工作菌种进行销毁。菌种斜面的培养、保藏条件及时间菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 3035 C 2224h营养琼脂培养基 2C8 C保存3个月 金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 3035C2224h营养琼脂培养基 2C8 C保存3个 月枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 3035C 2224h营养琼脂培养基 2C8 C保存3个月 铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104) 3035C2224h营养琼脂培养基 2C8 C保存3个月 乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 3035C2224h营养琼脂培养基 2C8 C保存 3 个月生孢梭菌(CMCC(B)64941) 30- 35 C 2224h营养琼脂培养基 2 C8 C保存3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001) 2328C最多7天改良马丁琼脂培养基2C8 C保存3个月黑曲霉(CMCC(F)98003) 23-28C最多7天改良马丁琼脂培养基 2C8 C保存3个月 短小芽孢杆菌(