分子生物学方法在食品安全检测中的应用

1、年第期月出版tr品工程© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版分子生物学方法在食品安全检测中的应用土鑫车振明黄韬睿两华大学生物工种学院成都© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishi

2、ng House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版摘 耍 综述了食品中病原微生物的快速检测方 法详述r 技术和基冈芯片这两种技术的研究 进展并对这两种方法特点与应用进行了探讨。关键词 仅品安全 微生物 基因芯片 检 测方法在 年 我国食品安全事件频发 福寿螺 爭件、人造蜂蜜事件、毒猪油事件、多宝他爭件等 等都再次给人们敲响了食品安全的警钟。随着食品 匸业的发展以及对食品安全的巫视传

3、统分析方法 已经远不能满足食品检测的需耍迫切盂耍灵敏度 更高、特界性更强、简便快捷的fr品安全检测技术 和方法因此近年來世界国的许多机构和学者 都致力于快速检测技术和方法的研究 改进和开发 了一些快速的检测技术和方法 现将儿种主耍方法 概述如下。技术 技术即聚合福 王鑫女年出生西华大学生物丁程学院在读硕I：研究生。收稿日期链式反应也称无细胞克隆系统是 年诞生的 一项 体外扩増技术 该技术自问世以來 就以 惊人的速度广泛地应用丁生命科学的众多领域。前 在食品工程领域中致病性微生物、转卑因tr品的检测 等方面的应用也越來越受关注。技术的基本原理与方法技术是一种利用变性与复性原理在体外利用聚合酶活性

4、在引物的引导和脱氧核糖核口酸等参与下将模板在数小时内进行百万倍扩増。该技术利用两段寡核口酸作为 反应的引物以及四种脱氧核昔三磷酸 、 聚合師作为反应物将提取到的 称为模 板片段精确扩増。该酚促反应最基本的个环节是模板 的变性即在°C下模板双 链变为单链引物与模板链的特异性复性由聚合幽催化引物引导琏山 向 延伸从而完成一个变性复性延伸 的 循环。至此完成了的第一轮反应 而后反复进行变性、复性和延伸的循环 从而使扩増 产鼠呈指数上升。技术在食品微生物检测方面的应用单核细胞増多性李斯特氏菌单核细胞增多性李斯特氏菌是一种巫耍的人备共患病致病病菌 能引起人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产等 且

5、死亡率极高可达 。 广泛存在于动物、水产品等中 主要通过食物进行传播。过去对 食胡中进行检测时克隆培养的标准方法需耍周的时间才能得出结果血涓学检测方法如等也存在着特异性、敏感性差等问题 技术的出现给李氏菌的检测带來J'曙光。姜永强等 根据发农的单核细胞増生性李斯特菌的巫耍毒力基 因的全皋囚字列 设计出引物 建立了该菌的 诊断方法。金大智等运用实时荧光技术建立对食晶中单増李氏菌进行检 测的快速方法 设计的引物和探针的序列特异性 强省去凝胶电泳的繁琐降低了污染的可能性。 对 种病原进彳j的检测结果表明用实时荧光 法检测单核细胞增多李斯特氏菌 更快速、敏 感、特异性更离。金黄色葡萄球菌金黄色

6、葡萄球菌肠帝素 可引起人类中毒 其内毒素一中毒休克综合症毒素 可引起中 毒休克综合症产生的脱皮毒索 、 与一系 列脓疱性匍籀球菌感染有关。等建立了检测上述毒素丛因的 技术可在较短的时间内检 测出匍轉球菌莓株并ILJI有极高的特异性、敏感 性。国内2；泓若等选择肠毒素基因的第 碱基为上游引物 第 碱基为下 游引物应用 技术扩增出 基因的 长的 片段并建立了肖接利用细繭裂解液作 为模板的方法。沙门氏菌等根据肠炎沙门氏菌克隆株貝有的属特异性序列片段设计出一对引物能快速地检测出肉食品标本中的沙门氏繭检测的 敏感性和特异性均为这保证了检测的准确性。沈孝民用技术对各种不同血消型的沙f J繭和C知被该菌污染

7、的鱼粉和动物产品的肉汤培养物 进行了检测 结果显示该方法特异性高 IL灵敬、 快速并可在 之内完成。肠弗素大肠杆菌肠毒素大肠杆菌简称耐热菌是一种嗜热、嗜 酸、好氧的细甫能从浓缩苹果汁中分离得到该 繭能经受巴氏杀菌而存活严巫影响浓缩果汁的胡 质国际上已有多起耐热菌导致犬规模果汁败坏事 件的报道。目前国际上耍求每苹果浓缩汁中耐热葡含帚小T 耐热菌超标已成为制约我国浓 缩苹果汁出口的主耍障碍之一。H前对耐热繭的检 测方法仍为常规的培养检测法耗时很长一般需 耍 才能出检测报告。检测结果的滞后性使 Z无法及时指导生产无法及时向生产线反馈信息 以采取相应的防范、控制与淸洗措施.技术能使微最的核酸在数小时之

8、内扩増至 原來的数白力倍以上只耍选择适合的引物就可 特异性地人量扩增某一特定的 片断至易检测 水平 因此理论上可以通过特异性地扩增耐热菌的 基因片断而对其实现快速检测。技术存在的主要问题及展望技术虽为一种快速、特异、灵敏、简便、 高效的检测新技术但其在食品中致毒、致病性微 生物检测的实际应用中也存在不少问题必须认真 分析乞种JI体情况采取必耍的措施以提高反应 的特斤件和做感件避兔假阳件或假阳件结果。污染问题是一种极为灵敏的反应一旦有极少臬外 源性 污染就可能出现假阳性结果所以在 操作时必须加以注意。假阴性问题仅品是复杂的反应基质影响 反应的因索 很多如果不能冇效排除各影响因素的干扰很可 能出现

9、假阴性结果。此外如果在 操作过程中 各种实验条件控制不当很容易导致产物突变也 会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的考 虑和排除措施。引物设计及靶序列选择引物的设计及靶序列的选择是决定 结果的 关键因素引物不同则扩増物不同如果引物的设 计不当则直接彩响对关键靶序列的选择降低检测的灵敏度和特异性真至完全失败。冈 而必须对扩增序列有充分的了解并规范 实 验室操作技术。尽竹 技术在tr品的微生物安全性检测方面 还存在着一些问题 但相信随着研究的深入 这项 技术必将得以完善并迅速成为可以信赖的快速检 测手段。基因芯片技术朋因芯片技术是鉴别微生物和转展因成分厳有 效的手段之一 为全而、快速、球确地进

10、行伶品安 全检测提供了一个崭新的平台。慕因芯片 芯 片、 微阵列技术是近十儿年來在生命科学领 域迅速发展起來的一项高新技术是一项基于基因 农达和堆肉功能研究的革命性技术 他综合了分子© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版王鑫分屮生物学方仏在僅胡安全检测中的应川© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期

11、月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的 垠新科学技术在生命科学和信息科学之.间架起了 道桥梁 是当今世界上高度交义、髙度综介的询 沿学科和研究热点。LI前基因芯片正在成为独品和 仅品原料检测中一种较新的方法检测仅品的营养 成分监骨仅品的卫生、安全和ft品质杲保证人 类健廉并FI将对整个食品领域产生深刻的影响。宰内芯片技术的基本原理与先进性将各种基因寡核伴酸点样F芯片表面微生物 样品 经 扩增后

12、 制备荧光标记探针 然 后再与芯片上的寡孩疔酸点朵交最后通过扌3描仪 定量和分析荧光分布模式來确定检测样品是否存在 某些特定微生物.该技术可检测各种介质中的微牛物研究复杂 微生物群体的皋凶农达。与传统的检测方法细肃培 养、生化鉴定、血消分型等相比 皐冈芯片技术的 先进性主耍体观在 基因芯片可以实现微生物的 鬲通量和并行险测-次实验即可得出全部结果 操作简便快速幣个检测只而 基本可以出结 果而传统方法一般需特异性强敏感性高。宰因芯片技术在食胡微生物检测方面的应用Cr品卫生检测中一个重耍的方面是及时准确的 检测出仃胡中的病原性微生物 这些致病微t物的 存在会严巫威协人类的健康.不洁或音带有致病菌

13、的fr品不仅造成大的经济损欠 还会严!（危害消 费者的健康 从食品的生产、加匸、运输、销倚、 消费的各个环节都极易被各种病菌污染。统计农明在抽检的一部分負胡中过去年由于受致 病菌污染而从市场上撤回的tr品数屋增加了 倍。中国在加入后而临同样的问题过去年中不仅发现了许多新的病菌而且一些已知病菌 也出现了抗性増强的趋势以前被认为无害的微生 物在获得致病基因和抗性厉也会导致许多致命的疾 病。由r缺乏介适的检测方法这些致病繭即使偶 尔出现在食品屮也不能及时被检测m來对人类 健康造成-定的威胁。仅品微生物的检验是确保茂 品质鼠和安全的重耍于段因此加强对有書病菌的 筛选与检测可有效防11：仓品被并种微生物

14、特别是 致病菌的污染和各种传染病的蔓延。传统的生化培养检测方法需耍经过儿天的微生 物培养和复杂的计数 操作繁朵 不能及时反映生 产过程或销售过程中的污染情况且灵敏度不高使得食品的安全检测潜在一定的危险给消费者带 來很大的威胁法快速比前者灵敏但成本高假阳性多也不是很好的检测食品微生物污染 的方法。基因芯片可广泛的应用于各种导致食卅| 败的致病菌的检测 该技术具有快速、准确、灵敏 等优点可以及时反映食品中微生物的污染情况。 国内外都已开始食品微生物检测芯片的研究 并収 得了一些肯定的结论。基冈芯片专一性好能够对食胡中污染的微生 物实现快速的在线检测及时反映茂品屮存在的问 题为危害分析的关键控制点提

15、供可行的权威性报告。芯片还能对农作物致病繭包括病带、细 菌、直菌和线虫迅速作出检测常常能达到株或属 的水平保证食胡原料的安全性能对畚类、水产 类进行微生物检测 鉴别乳制品的好坏 检测肉制 品的优劣 真实判断肉混合制品中某种成分的数 量。从 年开始我国每年都会爆发对虾流行 性病帝病其危書是灾难性的中国科存院海洋所 的徐洪涛借助 杂交技术将该病即的 作 成探针进行杂交从分子牛物学角度证明白斑病毒 感染是造成中国大陆对虾连年爆发流行 病的主耍原 因。基因芯片技术存在的问题与展魁存在问题展内芯片技术的研究和应用前景十分诱人但 作为一项新技术 仍有一些问题需耍解决 该技 术需要大量的已测知的、准确的 、

16、片段的信息 他们使该技术成为人规模、集成化和整体 获取生物信息的仃效手段*亍芯片制作工艺复 杂 信号检测也需专门的仪器设备 一般实验室难 以承担其高昂的费用样品制备和标记比较复 朵没有一个统一的质鼠控制标准实验室不能 共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了 基因芯片技术在食晶检测中的应用。解决方法与发展方向为使卑因芯片成为实验室研究或实践中可以普 遍采用的技术 须从以下儿方面着手解决问题 提高慕因芯片的特井件、币:宜性简化样品制备 和标记操作 増加信号检测的灵敏度 研制和 开发高度集成化的样胡制备、基因扩増、孩酸标记 及检测仪器。另外食胡及食品原料中不断出现的 新转入丛因及CT晶病原微生

17、物的复杂化也是茂品检测中应用基丙芯片技术需耍解决的问题。基因芯片技术尽管存在一定的不足和局限但 该技术八仃检测系统微型化、检测样胡微磺化的特 点同时兼I检测效率高、能同时分析多种基因或 诊断 序列的优势很适丁仅品中病原微生物 和转展因成分的检测及鉴定随着研究的不断深入 和技术的完善基因芯片技术一足会在食品科学研 究领域发挥越来越重要的作用。其他分子生物学检测技术核酸探针技术核酸探针是指带有标记的特异片断.根据碱基互补原则 核酸探针能特异性地与冃的 杂交垠后用特定的方法测定标记物.探针标记方 式分为放射性标记、非放射性标记。放射性标记的 核酸探针的特异性非常强检测病原微生物速度比 常规方法快得多

18、。U前用的较多的是用生物索 抗生物素蛋门系统标记的非放射性核酸探针该探 针已在沙门氏商、产肠毒索大肠杆商及乙型肝炎病 毒检测中得到了广泛应用。基因重组法由于基因重组尤其是转化作用仅出现丁同 种或亲缘关系分近的菌株Z间 所以堆因巫组技 术可以用丁细茵的分类和鉴定中。如用转化法测定 由食品传染的、能引起痢疾的志贺氏细菌。基内重 纽法无需对待測菌株进行纯培养而II无需什么特 殊的试剂和设备 简便易行 所以是一种很有前途 的鉴定法。食品安全检测方法的缺点和不足而TI还貝有灵敏 度高、操作简便、检测周期短、检测成本低等优 点。 探针杂交与 联介使用检测食胡微生 物将是今后tr品微生物检测技术的一个巫耍研究方 向若能克服两者存在的易污染产生假阳性结果的 缺失 相信大规模推广应用指日可待.参考文献姜永强雷诈荣李瑾等应用 方法检 定单孩细胞増多性李斯特菊 中华预防医 学杂志金大智谢明杰曹际姐代品中单增李氏菌 实时荧光 检测鉴定方法的建立 辽宁 师范大学学报自然科学版云泓若 李月琴 周天鸿 技术检测金黄色爸萄球繭肠毒索自然科学版沈孝民涂书淸用中沙门氏菌的研究基因 暨南大学学报技术检测动物产品 追究动物检疫社巍定屋 技术在食源性致病微生物检测中的应用 食晶科学王元平 吴淸平 张菊梅 等基因芯片技术及 贰在食品卫生微生物检测中的应用 中国 卫生检验杂志© 1994-20