饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMAPCR法

1、饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法河南省地方标准编制说明一、 编制的目的和意义单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）简称单增李斯特菌，是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患致病菌，主要存在于肉类、乳制品和蔬菜中，可引起脑膜炎、败血症和流产，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。自1961 年，英国首次报道2 例由单增李斯特菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿单增李斯特菌感染事件。 1985 年美国有 52 人死于食用受单增李斯特菌感染的软干酪。 2011 年美国 18 个州 72 人因食用受李

2、斯特菌污染的甜瓜而染病。在我国感染性腹泻致病菌中李斯特菌居首位。因此，建立快速、特异、灵敏的检测标准对于单增李斯特菌早期预防及疫情的有效控制至关重要。我国目前主要采用传统培养方法进行单增李斯特菌的检测，需要一周时间左右，费时费力。本次研究以单增李斯特菌溶血素蛋白的基因 Hly 序列为靶基因设计一对引物，采用EMA与 PCR相结合的方法进行检测，能够有效地区分单增李斯特菌的死菌与活菌，避免了因死菌 DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示， PCR检测单增李斯特菌的灵敏度在 1.0 × 102cfu/mL 左右，从预

3、增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要2d左右，与传统培养学方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中单增李斯特菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、 任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件河南省质量技术监督局关于下达 2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知（豫质监标发 2017104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法（立项编号：20171210481）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用

4、、快速的原则，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：NY/T 1902饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验，GB 4789.30食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB 19489实验室生物安全通用要求，GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR检测方法的建立1. 引物设计根据单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌Hly基因序列设计一对特异性引物。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增271 bp 大小的特异性引物对。表 1 引物序列引物序列片段大小上游5

5、'- GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT -3'271bp下游5'- CCACACTTGAGATATATGCAGGAGG -3'2. EMA-PCR方法参数的优化首先是探索单核细胞增生李斯特氏菌培养物的最佳致死方法和 EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入 EMA，制备成 EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行 PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳 EMA添加终浓度。其次是最佳曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分

6、别照射 0、 1、 2、4、 6、 8、 10min ，离心收集上清液，进行 PCR扩增。3. 确定方法的灵敏度和特异性。4. 用建立的单核细胞增生李斯特氏菌 EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与 NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验比对，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR检测方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。共对来自全国4个省（大部分样品来自

7、河南省）共计 216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；共检测出 1 批单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品，并对单核细胞增生李斯特氏菌进行了分离鉴定。同时与 NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验 进行了对比， 检测结果显示，EMA-PCR方法检测结果与传统培养法 NY/T 1902-2010 检测结果完全一致，但检测时间比传统培养法缩短了2-3 天的时间。通过对比发现，EMA-PCR方法具有准确、快速的特点，在应用推广方面具有一定的优势。第三阶段：标准的起草、修改与制定根据以上实验资料及所有参与实验人员意见，在系统统计、科学分析的基础上，组织有关专家起草了饲料中

8、单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测 EMA-PCR法河南省地方标准草案， 规定了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等，并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见，按照专家意见对标准草案进行多次修改完善，制定了当前的饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测 EMA-PCR法（草案）。项目主持人：吴志明，河南省兽药饲料监察所，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：高延玲：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和技术推广。方忠意：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定和检测方法的优化。董鹏：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和检测方法的建立。李金磊：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定

9、、校订和检测方法的建立。狄元冉：河南省兽药饲料监察所，负责标准的制定、校订和优化。四、主要内容的确定1. 检测方法基本原理EMA能够穿过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其基因组DNA发生不可逆转的结合，使死细菌和游离状态的DNA不能作为模板进行PCR扩增。根据单核细胞增生李斯特氏菌溶血素蛋白的基因 Hly 序列设计一对特异性引物，通过对样品进行EMA处理然后进行 PCR扩增及凝胶电泳分析，含单增李斯特菌活菌的样品会在 271 bp处出现一条目的条带，而含有单增李斯特菌死菌DNA及非单增李斯特菌的样品不会出现该条带。2.最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5

10、麦氏单位（ MCF）单增李斯特菌菌悬液中分别加入EMA，使其终浓度分别为0、 0.2 、 0.5 、 1、 2、 4、8 g/mL， PCR结果电泳图分别为图1，图 2，图3。由图可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA终浓度为0.5g/mL既能完全抑制0.5 MCF单增李斯特菌死菌的扩增。另向0.5 MCF活菌菌悬液加入EMA，使其终浓度分别为0、1、 2、4、 6、 8、10、 12、14、 16 g/mL，PCR电泳结果如图4。由图4 可以看出加入终浓度为4 g/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱，表明终浓度低于4 g/mL的EMA不会抑制单增李斯特菌活菌的扩增。图 1 煮沸处理注

11、： M： Marker ；1：阴性对照；2 ： 0 g/mL EMA； 3 ：0.2g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ：1 g/mL EMA； 6：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mLEMA图 2 紫外照射处理注： M： Marker ；1：阴性对照；2 ： 0 g/mL EMA；3： 0.2 g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ： 1 g/mL EMA； 6 ：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mL EMA图 3 异丙醇处理注： M： Marker ；1：阴性对照；2 ： 0 g/mL

12、 EMA；3： 0.2 g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ： 1 g/mL EMA； 6 ：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mL EMA图 4 EMA 抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌浓度注： M： Marker ；1：阴性对照； 2 ：0 g/mL EMA; 3：1 g/mL EMA； 4 ：2 g/mLEMA； 5 ：4 g/mL EMA；6： 8 g/mL EMA； 7 ：10 g/mL EMA； 8 ：12 g/mL EMA；9：14g/mL EMA；10： 16g/mL EMA将煮沸致死的0.5 MCF单增李斯特菌菌悬液，加入EM

13、A终浓度为0.5g/mL，黑暗环境下孵育5 min后，分别曝光0、1、2、4、 6、8、 10 min，处理后 PCR产物电泳结果如图5 所示。由图5可以看出只有不曝光的有条带，其他均无条带， 说明 EMA处理后，曝光 1 min ，即可使EMA与死菌充分交联。图 5 曝光时间注： M：Marker ；1：0 min； 2 ： 1 min； 3 ： 2 min； 4： 4 min； 5 ： 6 min； 6 ：8 min；7：10 min ； 8：阴性对照3. PCR 方法的灵敏度用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的单增李斯特菌菌落转接于5 mL灭菌去离子水中， 用比浊仪调至0.5 M

14、CF，系列稀释至10-1 -10 -8 ，以此为模板，按上述方法进行EMA-PCR试验，同时对检出的最低稀释度进行涂板计数，每个稀释度做3 个重复， 37 培养 24 h ，检测 PCR反应灵敏度。结果表明，建立的 PCR方法检测最底线是 1.3 × 102 cfu/mL （图 6）。图 6 PCR 灵敏度检测注： M： Marker ；1：阴性对照； 2 ：108 CFU； 3 ：107 CFU； 4：106 CFU； 5 ：105 CFU；6： 104 CFU； 7 ：103 CFU； 8 ：102 CFU； 9：10 CFU； 10：1 CFU4. PCR方法的特异性将单核细胞

15、增生李斯特氏菌标准菌株及其余待测菌株单菌落分别接种于LB 肉汤中过夜培养，取菌液作为PCR反应模板，按上述方法进行试验。结果如图7，由图可以看出以单增李斯特菌菌株为模板的PCR产物出现有1 条特异性的271 bp条带，与预测序列片段大小相符；阴性对照、 金黄色葡萄球菌、 志贺氏菌、大肠杆菌等10 株非李斯特氏菌及格氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌等5 株非单增李斯特菌菌株未出现任何扩增条带；同时也未发现有其他非特异性扩增条带，表明建立的PCR方法具有很高的特异性。图 7 PCR特异性注：M：Marker；1：单核细胞增生李斯特氏菌；2：阴性对照； 3：斯氏李斯特氏菌； 4：伊氏李斯特氏菌；5 ：威氏李斯特氏菌； 6：格氏李斯特氏菌； 7：英诺克李斯特氏菌；8：福氏志贺氏菌； 9：宋内氏志贺氏菌； 10：鲍氏志贺氏菌；11 ：金黄色葡萄球菌；12：大肠杆菌； 13：肠产毒性大肠杆菌； 14：肠致病性大肠杆菌； 15：鼠伤寒沙门氏菌： 16：肠炎沙门氏菌17：甲型副伤寒沙门氏菌5结果报告凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在271 bp 处出现一条目的条带（见图8），即可报告该样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。图 8 单核细胞增生李斯特氏菌活菌的 EMA-PCR鉴定注：