蛋白质类物质分析测定

1、2021-12-912021-12-92 蛋白质主要化学元素为蛋白质主要化学元素为C、H、O、N，碳水，碳水化合物、脂肪中只含有化合物、脂肪中只含有C 、H、O，不含氮，不含氮，所以含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的所以含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志。不同的蛋白质中氨基酸的构成比主要标志。不同的蛋白质中氨基酸的构成比例及方式不同，故不同的蛋白质含氮量不同。例及方式不同，故不同的蛋白质含氮量不同。一般蛋白质含氮虽为一般蛋白质含氮虽为16，即，即1份氮素相当份氮素相当于于625份蛋白质。此数值称为蛋白质系数，份蛋白质。此数值称为蛋白质系数，各种蛋白质的含氮量稍有不同，所以换算系各种蛋白

2、质的含氮量稍有不同，所以换算系数也有差别，如玉米为数也有差别，如玉米为625，小麦粉为，小麦粉为570，大麦等，大麦等583，大豆为，大豆为5.71。一般蛋。一般蛋白质的平均含氮量以白质的平均含氮量以16计算。计算。2021-12-93 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量，另一类是和折射率等测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。蛋白质测定最常用的

3、方法是凯氏定量。蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法。此外，双缩脲分光比色法、染料氮法。此外，双缩脲分光比色法、染料结合比色法、酚试剂法等也常用于蛋白结合比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定出于方法简便快速，多用质含量测定出于方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，采于生产单位质量控制分析。近年来，采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。析。 2021-12-94 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，最终产蛋白质可以被酶、酸或碱水解，最终产物为氨基酸。在常规检验中多测定样品物为氨基酸。在常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法中的氨基酸总量，

4、通常采用酸碱滴定法来完成。近年世界上已出现了多种氨基来完成。近年世界上已出现了多种氨基酸分析仪、近红外反射分析仪，可以快酸分析仪、近红外反射分析仪，可以快速、准确地测出各种氨基速、准确地测出各种氨基酸酸含量。含量。2021-12-95 测定有机总氮的主要方法是凯氏定氮测定有机总氮的主要方法是凯氏定氮法，它具有测定准确和操作简单的优点，法，它具有测定准确和操作简单的优点，常用作蛋白质测定的标准方法。凯氏定常用作蛋白质测定的标准方法。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性原料蛋氮法可用于所有动物性、植物性原料蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、以

5、及含氮色素等作生物碱、含氮类脂、以及含氮色素等作蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。果称为粗蛋白质含量。 2021-12-96 凯氏定氮法于凯氏定氮法于1833年提出，经长期改年提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、改进，迄今已演变成常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等多种方法。法等多种方法。 2021-12-97（一）原理（一）原理将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳

6、和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗根据标准酸消耗量量可计算出蛋白质的含量。可计算出蛋白质的含量。2021-12-98 试样与浓硫酸和催化剂一同加热，使有试样与浓硫酸和催化剂一同加热，使有机质破坏，蛋白质分解，其个碳和氢完全机质破坏，蛋白质分解，其个碳

7、和氢完全被硫酸的分解物氧化为二氧化碳和水逸去，被硫酸的分解物氧化为二氧化碳和水逸去，而氨则与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液而氨则与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中：中：2021-12-99l浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。碳、氢、氮。l浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：2021-12-910l二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性

8、溶液中：酸铵留在酸性溶液中：2021-12-911l硫酸钾：加入硫酸钾目的是为了提高溶硫酸钾：加入硫酸钾目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解。硫酸钾液的沸点，加快有机物的分解。硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在度，一般纯硫酸的沸点在340左右，而左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至添加硫酸钾后，可使温度提高至400以以上，而且随着消化过程中硫酸不断地被上，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断进出而使硫酸氢钾的浓分解，水分不断进出而使硫酸氢钾的浓度逐渐增大，放沸点不断升高，其反应度逐渐增大，放沸点不断升高，其反应式如下：

9、式如下：2021-12-9122021-12-913硫酸钾的加入量也不能太大，否则消化体硫酸钾的加入量也不能太大，否则消化体系温度过高会引起已生成的铵盐发生热系温度过高会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失，除硫酸钾外，分解析出氨而造成损失，除硫酸钾外，也可以加人硫酸钠、氯化钾等盐类来提也可以加人硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点效果不如硫酸钾。高沸点效果不如硫酸钾。2021-12-914l硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉等，但酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉等，但

10、考虑到效果、价格及环境污染等多种因考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜、使用时常素，应用最广泛的是硫酸铜、使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解，硫酸铜化剂以加速有机物的氧化分解，硫酸铜的作用机理如下所示；的作用机理如下所示；2021-12-915 反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜再有硫酸亚铜(褐色褐色)生成，溶液呈现清澈的二生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，价铜的篮绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到

11、达，以及下一步蒸馏时还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。作为碱性反应的指示剂。2021-12-916 2蒸馏蒸馏硫酸铵在碱件条件下释放出氨，通过加热硫酸铵在碱件条件下释放出氨，通过加热蒸馏，氨随水蒸汽蒸出：蒸馏，氨随水蒸汽蒸出：(NH4)2S04十十2NaOHNa2S04十十2H2O十十2NH3l 2021-12-9173吸收和滴定吸收和滴定 馏出来的氨，被硼酸溶液吸收，然后馏出来的氨，被硼酸溶液吸收，然后用盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，属用盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，属于盐类的滴定。硼酸为极微弱的酸，在于盐类的滴定。硼酸为极微弱的酸，在滴定中并不影响所用指示剂的变

12、色反应。滴定中并不影响所用指示剂的变色反应。根据盐酸溶液消耗的体积，计算总氮合根据盐酸溶液消耗的体积，计算总氮合量，再乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质量，再乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质的含量。的含量。2021-12-9182021-12-919 试样中往往含有一定的杂质或其他干试样中往往含有一定的杂质或其他干扰分析测定的成分，所以在分析测定前，扰分析测定的成分，所以在分析测定前，要对样品进行处理即根据被测物质和干要对样品进行处理即根据被测物质和干扰物质间性质上的差异，使用不同的分扰物质间性质上的差异，使用不同的分离方法，把被测物质同干忧物质分离开离方法，把被测物质同干忧物质分离开来，或者使干扰物质

13、分解除去，而能将来，或者使干扰物质分解除去，而能将被测物质浓缩，从而使分析测定得到理被测物质浓缩，从而使分析测定得到理想的结果。想的结果。2021-12-920l (1)3硼酸溶液。硼酸溶液。l (2)005N或或001NHCl标准溶液标准溶液 l 其余试剂同常量法。其余试剂同常量法。2021-12-921l (1)凯氏烧瓶凯氏烧瓶 125mL。 l (2)微量凯氏蒸馏装置。微量凯氏蒸馏装置。l (3)微量滴定管。微量滴定管。 2021-12-922 2021-12-923 精密称取样品精密称取样品021.0 g于于125mL凯氏烧凯氏烧瓶中，小心加入硫酸钾瓶中，小心加入硫酸钾3g，硫酸铜，硫

14、酸铜02g，浓硫酸浓硫酸20mL，瓶口放一漏斗，斜置电炉上，瓶口放一漏斗，斜置电炉上同常量法消化至溶液呈淡蓝绿色后，放冷。同常量法消化至溶液呈淡蓝绿色后，放冷。取蒸馏水取蒸馏水20 mL，徐徐加入凯氏瓶中，冷却，徐徐加入凯氏瓶中，冷却，转移入转移入100mL容量瓶中，摇匀，冷却后用水容量瓶中，摇匀，冷却后用水稀释至刻度，摇匀备用。稀释至刻度，摇匀备用。 2021-12-924 将自来水经将自来水经1注入蒸馏瓶夹层注入蒸馏瓶夹层2中，使水面稍低于中，使水面稍低于蒸馏瓶颈部的转弯处在蒸馏瓶颈部的转弯处在100mL锥形瓶中加入锥形瓶中加入l0mL 2硼酸溶液及硼酸溶液及2滴混合指示剂作吸收瓶滴混合指

15、示剂作吸收瓶5，按图示，按图示将冷凝器将冷凝器6的尖端插入吸收瓶液面以下。精密吸取样的尖端插入吸收瓶液面以下。精密吸取样品消化稀释液品消化稀释液10mL，由进样漏斗，由进样漏斗4注入到蒸馏瓶注入到蒸馏瓶3中，并以少量蒸馏水冲洗漏斗，流入蒸馏瓶内。取中，并以少量蒸馏水冲洗漏斗，流入蒸馏瓶内。取约约8mL40氢氧化钠溶掖由进样漏斗氢氧化钠溶掖由进样漏斗4注入蒸馏瓶注入蒸馏瓶中进行中和，中和至蒸馏瓶内溶液呈深蓝色为止。中进行中和，中和至蒸馏瓶内溶液呈深蓝色为止。以少量水冲洗漏斗，并立即用少量水将漏斗以少量水冲洗漏斗，并立即用少量水将漏斗4密密封以防漏气。加热蒸馏，封以防漏气。加热蒸馏，2021-12

16、-925 将蒸馏瓶夹层将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸，以蒸馏瓶内的水煮沸，以蒸馏瓶3内的样液沸腾开始计算时间，约内的样液沸腾开始计算时间，约10分钟分钟可蒸馏完毕。放下吸收瓶，使冷凝管下可蒸馏完毕。放下吸收瓶，使冷凝管下端离开波面，再蒸馏端离开波面，再蒸馏1分钟，用少量蒸馏分钟，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端外部，移走吸收瓶，水冲洗冷凝管下端外部，移走吸收瓶，关熄电炉关熄电炉 2021-12-926 用用005N或或001N盐酸标准溶液滴定盐酸标准溶液滴定呈灰红色为终点。记录消耗盐酸标准溶呈灰红色为终点。记录消耗盐酸标准溶液的体积液的体积VmL。 同时做试剂空白试验，记录空白试验消同时做试剂空白试验，记

17、录空白试验消耗盐酸标推溶液的体积耗盐酸标推溶液的体积V0mL。2021-12-927l式中式中 N盐酸标准溶液的当量浓度盐酸标准溶液的当量浓度l 10消化完用以蒸馏的样品稀释液体积消化完用以蒸馏的样品稀释液体积（ml）；）；l 100消化液稀释后的总体积消化液稀释后的总体积(mL)，l W称取样品的重量称取样品的重量g)2021-12-928 当关电炉后，蒸馏瓶当关电炉后，蒸馏瓶3内的废液立即流内的废液立即流入蒸馏瓶的夹层入蒸馏瓶的夹层2内，并经排水管内，并经排水管7徘出。徘出。再将装有蒸馏水的锥形瓶置于冷凝器再将装有蒸馏水的锥形瓶置于冷凝器6的的下方，将冷凝器的尖端插入水中，将蒸下方，将冷凝

18、器的尖端插入水中，将蒸馏瓶夹层馏瓶夹层2中的残液加热至沸，然后移去中的残液加热至沸，然后移去火源，锥形瓶中的蒸馏水即倒流入蒸馏火源，锥形瓶中的蒸馏水即倒流入蒸馏瓶瓶3中，再流入夹层中，再流入夹层2内，由排水管内，由排水管7排出。排出。按上法将仪器洗按上法将仪器洗23次即可。次即可。2021-12-929l (1)样品消化应在有抽风装置的抽风橱内进行。样品消化应在有抽风装置的抽风橱内进行。l (2)消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝的酸液消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝的酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促使消化完全。将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促使消化完全。l (3)消化样品时，如泡沫太多，可

19、加少量辛酸或石蜡消化样品时，如泡沫太多，可加少量辛酸或石蜡去泡，以防样品溢出。去泡，以防样品溢出。l (4)样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶完全样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶完全放冷后加入放冷后加入30过氧化氢过氧化氢23mL后再加热。后再加热。l (5)蒸馏装置耍严防氨逸出。蒸馏过程不能中途间断，蒸馏装置耍严防氨逸出。蒸馏过程不能中途间断，以免吸收液倒吸入样品湾中。以免吸收液倒吸入样品湾中。 2021-12-9302021-12-9312021-12-932 相同点：原理；计算方法。相同点：原理；计算方法。不同点：样品量；蒸馏方式；滴定时标准不同点：样品量；蒸馏方式；滴定时标准

20、酸液的浓度酸液的浓度2021-12-933l利用蛋白质能与重金属离子结合形成蛋利用蛋白质能与重金属离子结合形成蛋白质盐而变件沉淀的特性，在一定的条白质盐而变件沉淀的特性，在一定的条件下，将蛋白质氮和非蛋白质氮分离，件下，将蛋白质氮和非蛋白质氮分离，然后用凯氏定氟法分别进行定量。然后用凯氏定氟法分别进行定量。2021-12-934 （1）样品用水溶解，用醋酸铜沉淀蛋白质，而）样品用水溶解，用醋酸铜沉淀蛋白质，而非蛋白质则留存于溶液中。过滤后，用凯氏定非蛋白质则留存于溶液中。过滤后，用凯氏定氮法分别测定沉淀中和滤液中的氮。氮法分别测定沉淀中和滤液中的氮。（2）样品经粉碎加水磨至均匀后，转入离心管）

21、样品经粉碎加水磨至均匀后，转入离心管中，以氢氧化铜沉淀蛋白质，离心分离，并用中，以氢氧化铜沉淀蛋白质，离心分离，并用蒸馏水洗涤。用凯氏定氮法分别测定溶液中的蒸馏水洗涤。用凯氏定氮法分别测定溶液中的非蛋白质氮和沉淀中的蛋白质氮。非蛋白质氮和沉淀中的蛋白质氮。2021-12-9351原理原理 当脲被加热至当脲被加热至150一一160时，可由两个分子间时，可由两个分子间脱去一个氨分子面生成二缩脲脱去一个氨分子面生成二缩脲(也叫双缩脲也叫双缩脲)，双双缩脲缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物为双缩服反应。由于蛋白质分子中含有配合物为双缩服反应。由于蛋白质分

22、子中含有肽键肽键( coNH一一)，与双缩服结构相似，故也能，与双缩服结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为大吸收波长为560nm。2021-12-9362021-12-937 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子

23、及肉法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。类等样品测定。 2021-12-938l(1)分光光度计。分光光度计。l(2)离心机离心机(4000rmin)2021-12-939(1)碱性硫酸铜溶液：碱性硫酸铜溶液：l以甘油为稳定剂：将以甘油为稳定剂：将10ml10mol/L氢氧化钾和氢氧化钾和3.0mL甘油加到甘油加到937mL蒸馏水中，剧烈搅拌，同时蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入慢慢加入50mL 40gL硫酸铜硫酸铜(CuSO45H20)溶液。溶液。l以酒石酸钾钠作稳定剂：将以酒石酸钾钠作稳定剂：将10ml10mol/L氢氧化钾氢氧化钾和和20mL 250g/L酒石酸钾钠溶液

24、加到酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加入中，剧烈搅拌，同时慢慢加入40mL 40gL硫酸硫酸铜铜(CuSO45H20)溶液。溶液。l配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。则将生成氢氧化铜沉淀。(2)四氯化碳四氯化碳(CCl4)2021-12-940(1)标准曲线的绘制：以采用凯氏定氦法测出蛋白标准曲线的绘制：以采用凯氏定氦法测出蛋白质含量的样品作为标推蛋白质样。按蛋白质含质含量的样品作为标推蛋白质样。按蛋白质含量量40、50、60、70、80、90、100、110mg分分别称取混合均匀的标准蛋白质

25、样于别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支支50mL纳纳氏比色管中，然后各加入氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用四氯化碳，再用碱性硫酸钢溶液碱性硫酸钢溶液(或或)准确稀释至准确稀释至50mL，振，振摇摇10mim，静置，静置1h，取上层清液离心，取上层清液离心5min，取，取离心分离后的透明液于比色皿中，在离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。为纵坐标绘制标准曲线。2021-12-941l准确

26、称取样品适量准确称取样品适量(即使得蛋白质含量在即使得蛋白质含量在40110mg之间之间)于于50mL纳氏比色管中，纳氏比色管中，加加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度在相同条件下测其吸光度A。用测得的。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得蛋白质含量。进而由此求得蛋白质含量。2021-12-942式中：式中：m1一由标准曲线上查得的蛋白质质一由标准曲线上查得的蛋白质质量量 m样品质量，样品质量，g。2021-12-943(1)蛋白质的种类不同，对发色程度的影响蛋白质的种类不同，对发色程度

27、的影响不大。不大。(2)标准曲线做完整之后无需每次再做标标准曲线做完整之后无需每次再做标准曲线。准曲线。(3)含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。 (4)样品中有不溶性成分存在时，会给比样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难时可预先将蛋白质抽出色测定带来困难时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。后再进行测定。 2021-12-944(5)当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好会使测定值偏低。共存，则显色不好会使测定值偏低。（6）该方法比凯氏定氮法费用低、是最简）该方法比凯氏定氮法费用低、是最简单的方法；单的方法；

28、 （7）比福林酚法、紫外吸收法或比浊法）比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离；更少发生颜色偏离； （8）不需要测定非蛋白质来源的氮。）不需要测定非蛋白质来源的氮。 2021-12-945（1）不如福林酚法灵敏，）不如福林酚法灵敏，（2）如果存在胆汁素，结果偏高）如果存在胆汁素，结果偏高（3）高浓度的胺盐会干扰反应；）高浓度的胺盐会干扰反应；（4）不同蛋出质其最终反而产物不问，如明胶）不同蛋出质其最终反而产物不问，如明胶的双缩脲反应产生红紫色；的双缩脲反应产生红紫色；（5）如果有高浓度的脂或碳水化合物时最终）如果有高浓度的脂或碳水化合物时最终的反应溶液会呈乳出色的反应溶液会呈乳出色（6

29、）需已知浓度的蛋出质）需已知浓度的蛋出质(如如B5A)或经凯氏定氮或经凯氏定氮样品校正。样品校正。 2021-12-946l1、原理、原理 蛋白质与福林酚试剂生成的复合物呈蓝色，蛋白质与福林酚试剂生成的复合物呈蓝色，其中蛋白质的肽键与碱性铜离子反比形成双缩其中蛋白质的肽键与碱性铜离子反比形成双缩脲反应。蛋白质变性，其中的的酪氨酸和色酪脲反应。蛋白质变性，其中的的酪氨酸和色酪氨酸同磷钼酸氨酸同磷钼酸磷钨酸试剂反应产生颜色，在磷钨酸试剂反应产生颜色，在750nm（对低浓度蛋白质有较高的灵敏度）或（对低浓度蛋白质有较高的灵敏度）或在在750nm(对高浓度蛋白质有较低的灵敏度对高浓度蛋白质有较低的灵敏

30、度)处处比色，蛋白质浓度与吸光皮的线件关系。比色，蛋白质浓度与吸光皮的线件关系。2021-12-9472、方法、方法（1）将待测的蛋白质样品稀释成合适的浓）将待测的蛋白质样品稀释成合适的浓度度(20100ug/ml)（2）加入酒石酸钾钠）加入酒石酸钾钠碳酸钠溶液：碳酸钠溶液：（3）冷却并在常温放置）冷却并在常温放置10min，加入硫酸，加入硫酸铜酒石酸钾钠、氢氧化钠溶液铜酒石酸钾钠、氢氧化钠溶液（4）加入新配制的福林酚试剂、混合均匀，）加入新配制的福林酚试剂、混合均匀，50放置放置10min。在。在650?nm处比色处比色 2021-12-948优点优点l非常灵极：较双缩脲法灵敏非常灵极：较双

31、缩脲法灵敏50100倍；倍；较较280nm紫外吸收法灵敏倍紫外吸收法灵敏倍1020倍。倍。l测定结果较少受到样品沏浊度的影响测定结果较少受到样品沏浊度的影响l特异性要高于其他大多数力召；特异性要高于其他大多数力召；l操作相对简单，操作相对简单，2021-12-949缺点缺点l反应产生的颜色比双缩脲法更易受白质的种类反应产生的颜色比双缩脲法更易受白质的种类变化而变化变化而变化l反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比；正比；l蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单糖会不同程度蔗糖、脂类、磷酸盐缓冲液、单糖会不同程度的干扰反应；的干扰反应；l高浓度的还原糖、硫酸铵

32、和巯基化食物会干扰高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化食物会干扰反应。反应。2021-12-9501、原理、原理 由于蛋白质分子中存在着含共扼双键由于蛋白质分子中存在着含共扼双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在收紫外线的性质，吸收高峰在280nm处。处。在此波长范围，蛋白质溶液的光吸收值在此波长范围，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度成正比，可用作定量测定。与其浓度成正比，可用作定量测定。 本法适用于蛋自质浓度在本法适用于蛋自质浓度在0一一1g/L范围范围内样品的测定。内样品的测定。 2021-12-9512、主要仪器、主要仪器 紫外分光光度计

33、。紫外分光光度计。3、试剂、试剂 标准蛋白质溶液：准确称取经凯标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的标准蛋白质结晶牛血清氏定氮法校正的标准蛋白质结晶牛血清蛋白，用水配制成浓度为蛋白，用水配制成浓度为1mg/mL的溶的溶液。也可采用经凯氏定氮法校止过的卵液。也可采用经凯氏定氮法校止过的卵清蛋白用浓度为清蛋白用浓度为0.9的氯化纳溶液配的氯化纳溶液配制成浓度为制成浓度为1mg/mL的溶液溶液。的溶液溶液。2021-12-952（1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制 分别移取标准蛋白质溶液分别移取标准蛋白质溶液0.5ml、1.0mL、1.5mL、2.0mI、2.5mL、3.0mL、4.0mL于试于

34、试管中，加蒸馏水至管中，加蒸馏水至4mL，摇匀，以蒸馏水调零，摇匀，以蒸馏水调零，用用1cm的石英比色皿，在波长的石英比色皿，在波长280nm处测定各处测定各管溶液的吸光度值管溶液的吸光度值(A280nm)。以。以A280nm值值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。线。2021-12-953(2)样品制备样品制备(3)样品测定样品测定 吸取吸取1mI样品稀释液样品稀释液(蛋白质蛋白质含量约为含量约为1mg/mL)加蒸馏水加蒸馏水3mL，摇，摇匀，披上述方法在匀，披上述方法在280nm波长处测定吸波长处测定吸光度值，并从标准曲线上查出待测样品光度值

35、，并从标准曲线上查出待测样品中蛋白质的浓度。中蛋白质的浓度。2021-12-954l利用紫外线吸收法测定蛋白质具有操作简便、利用紫外线吸收法测定蛋白质具有操作简便、快速，低浓度盐类不干扰定等优点，仪在测定快速，低浓度盐类不干扰定等优点，仪在测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质时有一定的误差。大的蛋白质时有一定的误差。l根据测定需要，紫外线吸收法测定蛋白质还可根据测定需要，紫外线吸收法测定蛋白质还可采用采用A280nm和和A260nm比值法、比值法、A215nm和和A225nm吸收差法、肽键紫外光测定法等。吸收差法、肽键紫外光测定法等。l

36、若样品中含有碱基等吸收紫外线的物质时，会若样品中含有碱基等吸收紫外线的物质时，会出现较大的干扰出现较大的干扰。2021-12-9551、原理、原理 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250与蛋白质结合与蛋白质结合时，时，G-250会从红色变成兰包，其最大会从红色变成兰包，其最大吸收波长从吸收波长从465nm变化至变化至595nm，在，在595nm处的吸光度与样品中蛋白质的浓处的吸光度与样品中蛋白质的浓度成正比。度成正比。2021-12-956（1）将考马斯亮兰）将考马斯亮兰G-250溶解于溶解于95酒精酒精中，并用中，并用85磷酸酸化；磷酸酸化；（2）将含有蛋白质）将含有蛋白质(1一一100ug/L)的

37、样品和的样品和标准标准BSA溶液分别与溶液分别与bradford试剂混合：试剂混合： (3)在在595nm处读取吸光度并扣空白；处读取吸光度并扣空白；（4）样品中的蛋白质浓度通过标准曲线计）样品中的蛋白质浓度通过标准曲线计算。算。2021-12-957（1）快速，反应可在）快速，反应可在2min内完成；内完成；（2）重现性好；）重现性好；（3）灵敏度高，比福林酚法要高好几倍：）灵敏度高，比福林酚法要高好几倍：（4）不受阳离子、硫酸铵、多酚、糖类物）不受阳离子、硫酸铵、多酚、糖类物质干扰，受表面活性剂干扰。质干扰，受表面活性剂干扰。（5）可测大分子量蛋白质的浓度；）可测大分子量蛋白质的浓度；20

38、21-12-958 氨基酸一直是某些发酵产品如调味品氨基酸一直是某些发酵产品如调味品的质量指标，也是日前许多保健食品的的质量指标，也是日前许多保健食品的质量指标之一。其含氮量可直接测定，质量指标之一。其含氮量可直接测定，不同于蛋白质的氮。故称氨基酸态氮。不同于蛋白质的氮。故称氨基酸态氮。2021-12-959(一一)原理原理 氨基酸是同时具有氨基与羧基的两性氨基酸是同时具有氨基与羧基的两性化合物，它们会互相作用生成分子内盐，化合物，它们会互相作用生成分子内盐，故不能用氢氧化钠标准溶液直接滴定，故不能用氢氧化钠标准溶液直接滴定，而采用加入甲醛，使氨基的碱性被掩蔽，而采用加入甲醛，使氨基的碱性被掩

39、蔽，羧基显示出酸性，再以氢氧化钠标准溶羧基显示出酸性，再以氢氧化钠标准溶液滴定，用酚酞或酸度计指示终点。液滴定，用酚酞或酸度计指示终点。 2021-12-9602021-12-9611、试剂、试剂l36甲醛中性溶液，加入酚酞，用甲醛中性溶液，加入酚酞，用NaOH标准溶液滴定至微红，备用。标准溶液滴定至微红，备用。lO.05NaOH标准溶液标准溶液l0.1酚酞指示剂酚酞指示剂2021-12-962（1）样品处理）样品处理 准确称取准确称取0.2g(m)样品，加入样品，加入5ml10乙酸，研磨均匀，用水转移到乙酸，研磨均匀，用水转移到50ml容容量瓶中定容，过滤，弃去初过滤液（？）。量瓶中定容，过

40、滤，弃去初过滤液（？）。（2）滴定）滴定 准确吸取试样准确吸取试样2mL，置锥形瓶中，加，置锥形瓶中，加水及酚酞指示剂滴，用水及酚酞指示剂滴，用001N NaOH(浓度：浓度：c)标准溶液滴定至刚显粉红色半分钟不褪为终点。标准溶液滴定至刚显粉红色半分钟不褪为终点。记录此次消耗氢氧化钠液的体积记录此次消耗氢氧化钠液的体积V2，向上述溶，向上述溶液中准确加入甲醛液中准确加入甲醛2mL，混匀，再用，混匀，再用NaOH标标准液滴定至微红，记录此次消耗氢氧化钠液的准液滴定至微红，记录此次消耗氢氧化钠液的体积体积V2，作计算氨基酸态氮用。，作计算氨基酸态氮用。2021-12-963氨基酸态氮氨基酸态氮(g

41、100mL)(V2-V1) c0.0141/2501/m1002021-12-964（1）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。（2）固体样品应先进行粉碎，准确称样后）固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液，液体试样如用水萃取，然后测定萃取液，液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在萃取可在50水浴进行水浴进行0.5h即可。即可。2021-12-965(3)样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。再测定，或用电位滴定法进行测定。(4)与

42、本法类似的还有双指示剂与本法类似的还有双指示剂(百里酚酞百里酚酞)甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和pH为为8.59.5，分析结果好。，分析结果好。（5）Pro存在时结果偏低；酪氨酸、铵盐、存在时结果偏低；酪氨酸、铵盐、酰胺存在时结果偏高。酰胺存在时结果偏高。 2021-12-9661、试剂、试剂 (1)、01百里酚蓝百里酚蓝(麝香草酚蓝麝香草酚蓝)指示指示剂剂 (2)、36甲醛中性溶液，加入酚酞，用甲醛中性溶液，加入酚酞，用NaOH标准溶液滴定至微红，备用。标准溶液滴定至微红，备用。 (3)、O.05NaOH标准溶液。标准溶液。 (4)、0.1酚酞指示剂酚酞指示

43、剂 2021-12-967 (1)、中和游离酸、中和游离酸 准确吸取酱油试样准确吸取酱油试样5mL，置，置100mL容量容量瓶中，加水至刻度，摇匀。吸取此稀释液瓶中，加水至刻度，摇匀。吸取此稀释液20mL于于250mL锥形瓶中，加水锥形瓶中，加水l00mL及酚酞及酚酞指示剂指示剂3滴，用滴，用005N NaoH标准溶液滴定至标准溶液滴定至刚显粉红色半分钟不褪为终点。若测酱油的总刚显粉红色半分钟不褪为终点。若测酱油的总酸，则记录消耗氢氧化铂钠溶液体积酸，则记录消耗氢氧化铂钠溶液体积V1、，作、，作计算总酸用。酱油的总酸以乳酸表示。计算总酸用。酱油的总酸以乳酸表示。 2021-12-968(2)氨

44、基酸态氮的测定氨基酸态氮的测定 向上述溶液中准确加入甲醛向上述溶液中准确加入甲醛10mL，混，混匀，再加入百里酚监指示剂匀，再加入百里酚监指示剂l mL，用，用005N NaOH标准液滴定至蓝紫色标准液滴定至蓝紫色(pH92)，记录此次消耗氢氧化钠液的，记录此次消耗氢氧化钠液的体积体积V2，作计算氨基酸态氮用。，作计算氨基酸态氮用。 2021-12-969(3)、空白试验、空白试验 取水取水100mL，加酚酞指示刑，加酚酞指示刑3摘，用摘，用005N NaOH标准液中和至刚显粉红色记录消耗氢标准液中和至刚显粉红色记录消耗氢氧化钠的体积氧化钠的体积V0，作总酸计算时的空白。再淮，作总酸计算时的空白。再淮确加入甲醛确加入甲醛10mL，百里酚蓝指水剂，百里酚蓝指水剂lmL，混，混匀，用匀，用005N NaOH标准液滴定至蓝紫色，标准液滴定至蓝紫色，记录用去氢氧化钠液的体积记录用去氢氧化钠液的体积V 0，作氨基酸态，作氨基酸态氮计算时的空白。氮计算时的空白。 2021-12-970l 总酸总酸(以乳酸计，以乳酸计，g/100mL)(V1-V0)N0.09100/(205)100l 氨基酸态氮氨基酸态氮(g100mL)(V2-V 0)N0.014100/(205)100式中式中 0.09乳酸的毫克当量乳酸的毫克当量(g) 0.014氨基酸态氮的毫克当量氨基酸态氮