海藻油DHA-国家食品安全风险评价中心

1、、添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围2.1名称通用名：BbgIV伊半乳糖告酶英文名：BbgIV 伊galactosidaseIUBMB化学名：,半乳糖甘酶IUBMB编号EC 3.2.1.23CAS号9031-11-2EINECS 号:232-864-1同义词：乳糖酶来源：两岐双岐杆菌 (Bifidobacterium bifidum )2.2功能分类、用量和使用范围4申报功能为酶制剂，用于生产低聚半乳糖。3半乳糖甘酶是食品添加剂 GB2760-2011中规定允许用的酶制剂，其来源的微生物包 括胞壁克鲁维酵母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母等。2014年6月24日卫生计生委公开征求意见的“

2、低聚半乳糖国家标准”（国卫食品函【2014 527号），范围中规定：“本标准适用于以乳糖为原料，经环状芽抱杆菌及 GB 2760批准使用的 菌种生产的B -半乳糖普酶催化水解半乳糖昔键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时通过 转移半乳糖昔的作用，将水解下来的半乳糖甘转移到乳糖分子，生成的食品营养强化剂低聚 半乳糖。”克拉萨多配料有限公司（克拉萨多）出品的低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂BbglV伊半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌NCIMB 41171 （两岐双岐杆菌 B. bifidum strain, NCIMB41171,来源于人类健康志愿者（Tzortzis et al., 2005）。两岐

3、双岐杆菌不在 GB2760-2011规定 的伊半乳糖甘酶来源的微生物名单中，也不在正在征求意见的食品营养强化剂低聚半乳糖国 标中规定的3 -半乳糖甘酶来源的微生物名单中，因此本公司特申请两歧双岐杆菌来源的3-半乳糖普酶作为酶制剂，主要用来生产低聚半乳糖。两岐双岐杆菌常用作益生菌，两岐双岐杆菌在食品工业中早已广泛应用，EFSA将其列在OPS名单中，也在卫生部发布的可用于食品的菌种名单（卫办监督发201065号）中,已在食品和保健食品中广泛应用，是安全性极高的菌种。同样的，用两岐双岐杆菌生产的B半乳糖甘酶是非常安全的，不用担心其毒性、过敏性和其他不良效应。2.3使用量和使用范围按1G Good M

4、anufacturing Practice （cGMP） 原则，BbglV 伊半乳糖甘酶使用原则是依照达到最大效果的最小使用量来使用。克拉萨多公司经过反复研究确认，生产低聚半乳糖所需要的酶的典型使用量是：每公斤乳糖需要0.1到0.22 g酶。生产Bimuno ?必米诺 （低聚半乳糖）糖号B BbgIV伊半乳糖甘酶的典型添加量是0.013%（w/w）。克拉萨多公司申请的BbgIV伊半乳糖甘酶仅用于生产本公司的产品Bimuno ?必米诺（低聚半乳糖），且本公司生产的Bimuno ?必米诺（低聚半乳糖）已在欧盟、美国、澳大利亚和新西兰、韩国等国家广泛应用，被批准用在婴幼儿食品及各类食品和膳食补充剂中

5、为半乳糖甘酶第三部分：证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件三、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件低聚半乳糖对肠内的益生菌群有很强的增殖作用，被双岐杆菌等益生菌利用，刺激肠道双岐杆菌的生长，减少有害微生物的生长和有害发酵产物的生成，同时具有和植物膳食纤维相同效用，可促进肠胃蠕动，改善肠道功能。因此我国已批准低聚半乳糖允许用在婴幼儿食品中，新资源食品也已批准低聚半乳糖作为食品原料广泛用在食品中。欧盟、美国、日本、韩国、澳大利亚新西兰等许多国家也已批准低聚半乳糖作为益生元物质在婴幼儿食品及各类 食品中广泛使用。低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经B-半乳糖普酶催化水解半乳糖昔键，生成

6、半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖昔的作用，将水解下来的半乳糖 甘转移到乳糖分子，生成低聚半乳 糖。而其中，影响低聚半乳糖功效性的决定性因素，就是工艺中用于催化水解的酶制剂：3-半乳糖甘酶的来源的不同，相应的低聚半乳糖的功效也不同。不同菌种来源生产的B -半乳糖普酶作为酶制剂生产得到的低聚半乳糖产品，其功效性也有很大的不同。3半乳糖甘酶是食品添加剂 GB2760-2011中批准的可以使用的酶制剂，主要来源包括 胞壁克鲁维酵母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母等。而新资源批准的低聚半乳糖中所使用 的伊半乳糖甘酶来源为环状芽抱杆菌，不在GB2760-2011批准之列。克拉萨多配料有限公司(克拉萨多)出品的

7、低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂BbglV3半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌NCIMB 41171 (两岐双岐杆菌 B. bifidum strain, NCIMB41171,来源于人类健康志愿者(Tzortzis et al., 2005),属于双歧杆菌菌属。3.1 功能类别及作用机理以益生菌为来源生产B -半乳糖甘酶的基本原理是：酶的起源，对终产品低聚半乳糖的组分以及功效都非常重要。来源于益生菌的3 -半乳糖甘酶从乳糖中催化合成的低聚半乳糖产品，更容易被B -半乳糖甘酶所来源的益生菌进行代谢，达到益生菌对益生元物质更高的选择性(Rabiu et al., 2001)。双歧杆菌是肠道益生菌，有维

8、护肠道正常细菌菌群平衡、抑制病原菌的生长，防止便秘，腹泻和胃肠障碍等功效；此外还可改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率，增强人体免疫机能。因此以两歧双岐杆菌为来源的B -半乳糖甘酶作为酶催化水解从乳糖中制取的低聚半乳糖产品，例如克拉萨多公司的 Bimuno ?必米诺产品，跟其他低聚半乳糖产品相比，其功效上有更多优势，尤其对双歧杆菌菌属有更局的选择性LactoseGalacto-oligosaccharide图1 ：伊半乳糖甘酶催化的低聚半乳糖的合成3.1.1 两岐双岐杆菌来源的伊半乳糖甘酶的活性对两岐双岐杆菌来源的 BbglV伊半乳糖甘酶的活性进行了研究。BbglV伊半乳糖甘酶的活 性定义如下：一

9、个单位酶活性定义为每分钟( pH 6.8和40oC)催化生成1微摩尔邻硝基苯 的生成率，用 对硝基苯基-伊D-叱喃半乳糖昔制备标准校正曲线。Goulas et al. (2009)。对理想的pH和温度进行研究，见图 2和 图3,表示热和PH稳定性, 在55 °C以上时活性失活。图2:在pH (1)和 温度下(2),理想的B-半乳糖甘酶活性(1) pH活性020406080Temperature PC)(2)温度活性(pH 6.5)图3: BbglV伊半乳糖甘酶活性pH (1)和热稳定性(2)Temperature (X)pHpH稳定性(55 C, 1小时处理) 热稳定性(pH 6.5

10、, 1小时处理)3.1.2 底物特异性Goulas et al. (2009)对来源于两岐双岐杆菌 NCIMB 41171 的小半乳糖酶底物特异性进行了研究，研究结果见表 1表1:来源于两岐双岐杆菌 NCIMB 41171的B-半乳糖酶底物特异性底物%相对活性U/mg乳糖1001903-D-(1 6)半乳二糖4.7 ±0.99.03-D-(1 T)半乳二糖-伊D-(1 T)半乳糖基乳糖-N-乙酰乳糖胺61.1 42116.0Lacto-N-Biose I-乳果糖3.5 ±0.56.6岩藻五糖-土标准偏差，n=3 ,(-)表小未检出。底物为乳糖的B -半乳糖酶活性最强。3.1

11、.3 储存稳定性伊半乳糖酶储存在(-18 C),仍在起始酶活性的10 %范围之内，研究结果保存期在12个月之内months(更 awwe E+JEajH3.2 以两歧双歧杆菌为来源的3 -半乳糖甘酶生产的低聚半乳糖（Bimuno ）和其他来源的3 -半 乳糖甘酶生产的低聚半乳糖（Vivinol GOS ）的效果比较克拉萨多公司从两岐双岐杆菌 NCIMB 41171中制取B-半乳糖甘酶，主要是用于生产克拉 萨多公司的低聚半乳糖产品 Bimuno ?必米诺。必米诺是以乳糖为原料，通过B -半乳糖甘酶对 乳糖中的低聚糖作用转化而得到的半乳糖混合物。通常，乳糖碳链通过这种方法主要转化为 双糖、三糖、四

12、糖及五糖物质。3.2.1 酶来源Vivinal GOS （同类产品）和 Bimuno （必米诺,克拉萨多产品）都是天然的 GOS （低 聚半乳糖）食品补充剂，都是利用天然存在的半乳糖甘酶从乳糖中生产所得。这些酶都是由非致病性微生物（表1）而来，经过特定的条件刺激，催化乳糖依照通用流程（ E:酶；Lac: 乳糖；Glu:葡萄糖；Gal:半乳糖；Nu :核受体） 转化为GOS （低聚半乳糖）。Gal + EE+LacGluE - GalGal -Nu + E表1: ViVinal和Biminuo生产过程中所使用的酶Vivinal GOSBi2muno ?Enzymes 酶 Micro-organi

13、smBiohazard level Taxonomy Gram Stain Human Health微生物生物危害级别分类学革兰氏染液人类健康B-galactosidase 伊半乳糖甘酶 Bacillus circulans 环状芽抱杆菌1 Bacterium 细菌 Positive 阳性Although not a major pathogen, B. circulans has been reported to cause infections虽然不是主要的病原体，环 状芽抱杆菌曾被报告引起 感染B-galactosidase 伊半乳糖甘酶 Bifidobacterium bifidum

14、两歧双歧杆菌1 Bacterium 细菌 Positive阳性Lactic acid bacterium GRAS, extensive use as probiotic乳酸菌GRAS 作为益生菌了泛使用*用于生产Bimuno ?必米诺的酶是两歧双歧杆菌细胞的固定化酶3.2.2 生产Vivinal GOS的生产，是乳清乳糖在批式反应器中经过酶孵化后精炼而来，然后对孵化液进 行脱色，蒸发处理得到糖浆，或者喷雾干燥得到粉末，然后包装Bimuno ?必米诺的生产，是乳清乳糖在批式反应器中经过固化酶（两歧双歧杆菌细胞）孵化 后精炼而来，然后通过离心分离出去固化酶，溶液经过纳米过滤，蒸发得到糖浆，包装；

15、或 者通过喷雾干燥制成粉末，包装。3.2.3 GOS （彳氐聚半孚L糖）组分两个产品都是由不同长度的低聚半乳糖链组成的。（表2）表2:两种产品的碳链和GOS含量百分比Vivinal GOSBi2munoMonosaccharides单糖2323Disaccharides (of which lactose)二糖(其中乳糖)32 (20)32 (15)GOS (DP>=3)4545两种产品糖浆理化指标和微生物属性Vivinal GOSBi2munoDry matter (w/w)干物质75%75%Galacto-oligosaccharides低聚半乳糖含量60% on DM62% on

16、DMLactose 乳糖20% on DM15% on DMGlucose葡萄糖19% on DM22% on DMGalactose半乳糖1% on DM1% on DMProtein蛋白质0.03% on DM0.03% on DMAsh灰分0.15% on DM0.04% on DM微生物c.f.u.母克粉 微生物，每克粉中Total viable counts总活菌数< 300080Enterobacteriaceae肠杆菌科Absent in 1 g未检出< 10Salmonella沙门氏菌Absent in 25g不得检出Absent in 25g不得检出Yeast酵母

17、< 50< 10Moulds霉菌< 50< 103.2.4营养价值两种产品都是低分子量的水溶性膳食纤维，依照这两种产品的碳水化合物组分来看, Vivinal GOS 的卡路里是 2.2 Kcal/g , Bimuno 的是 2Kcal/g。3.2.5 新陈代谢两种产品都是不易消化的低聚糖混合物，直接到达结肠，在那里经过定殖的益生菌发酵,从而促进双歧杆菌和乳酸菌的生长（益生元的属性）鉴于Bimuno生产中所使用的酶的来源，相比Vivinal GOS.来说，Bimuno是一种更高效的益生元，因为其对双歧杆菌有更高的亲 和力。3.2.6 适用范围两种产品都可以既当作可溶性纤维

18、使用，发挥益生元的作用，也可以当作食品配料添加 于食品或者膳食补充剂里。3.2.7 不良物与Vivinal GOS相比，Bimuno没有任何不良物质。对于这两种产品来说，唯一的不同就 是生产过程中使用酶的方式不同。Vivinal GOS是用没有去除的纯蛋白生产的，Bimuno是用双歧杆菌细胞（鉴于溶液的高糖度以及低水活度，不活跃代谢）固化酶生产的，这个固化酶随后被从终产品完全去除。（参见上述表2微生物分析）3.3 使用两岐双岐杆菌 NCIMB 41171来源的（3 -半乳糖甘酶和不使用的效果比较3 -半乳糖甘酶是食品添加剂 GB2760-2011中批准的可以使用的酶制剂，主要来源包括壁克鲁维酵

19、母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母等。而新资源批准的低聚半乳糖中所使用的3 -半乳糖甘酶来源为环状芽抱杆菌，不在GB2760-2011批准之列。克拉萨多配料有限公司（克拉萨多）出品的低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂BbgIV 3 -半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌 NCIMB 41171 （两岐双岐杆菌 B. bifidum strain, NCIMB 41171, 来源于人类健康志愿者（Tzortzis et al., 2005）,属于双歧杆菌菌属3.3.1安全性比较两岐双岐杆菌常用作益生菌，两岐双岐杆菌在食品工业中早已广泛应用，EFSA将其列在 OPS名单中，也在卫生部发布的可用于食品的菌种名单

20、（卫办监督发201065号）中，已在食品和保健食品中广泛应用，是安全性极高的菌种。同样的，用两岐双岐杆菌生产的3-半乳糖甘酶是非常安全的，不用担心其毒性、过敏性和其他不良效应。表1 :使用和不使用酶的安全性比较不使用使用酶伊半乳糖甘酶伊半乳糖甘酶微生物环状芽抱杆菌两歧双歧杆菌生物危害级别11细菌细菌分类学阳性阳性革兰氏染液虽然不是主要的病原体，环状芽乳酸菌GRAS人类健康抱杆菌曾被报告引起感染J作为益生菌了泛使用 两歧双歧杆菌（B. bifidum NCIMB 41171 ）是一种与人类共栖的益生菌种，而且两歧双歧杆菌种属被当做益生菌配料而广泛使用。(Mogensen et al., 2002

21、)。双歧杆菌种属用于食品生产的安全性经过广泛的，全球多个权威专家团体的评估，包括欧盟FEEDAP 小组，食品安全局。(Holzapfel et al. ,1998; Saarela et al., 2002; Borrielo et al., 2003;Picard et al., 2005; Boyle et al., 2006; EFSA, 2007, 2012; Vankerckhoven et al., 2008).两歧双歧杆菌于2007年被欧洲食品安全委员会授予QPS认证，确定保持为年度评估。(EFSA,2007, 2012).依据两歧双歧杆菌这一种类其广泛的安全特T完全可以论证以两

22、歧双歧杆菌NCIMB41171为来源的 伊半乳糖甘酶没任何安全疑虑。众多科学研究都证明，这一种属的所有产品，均没有毒性、过敏、或者其他任何不良品的报告。3.3.2功效性比较以益生菌为来源生产B -半乳糖甘酶的基本原理是：酶的起源，对终产品低聚半乳糖的组分以及功效都非常重要。双歧杆菌是肠道益生菌，有维护肠道正常细菌菌群平衡、抑制病原菌的生长，防止便秘，腹泻 和胃肠障碍等功效；此外还可改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率，增强人体免疫机能。因此以 两歧双岐杆菌为来源的3 -半乳糖甘酶作为酶催化水解从乳糖中制取的低聚半乳糖产品，例如克拉萨多公司的Bimuno?必米诺产品，跟其他低聚半乳糖产品相比，其功效

23、上有更多优势，尤其对双 歧杆菌菌属有更高的选择性。来源于益生菌的3-半乳糖甘酶从乳糖中催化合成的低聚半乳糖产品，更容易被3-半乳糖甘酶所来源的益生菌进行代谢，达到益生菌又益生元物质更高的选择性( (Rabiu et al., 2001)。以两歧双歧杆菌为来源的3半乳糖甘酶生产的低聚半乳糖产品Biminuo在极低的使用量下，能够快速有效提升双歧杆菌数量和功效。 服用3.6g必米诺(纯1.37g GOS),能够快速有效提升双歧杆菌功效(Depeint et al., 2008)? Bimuno必米诺特别针对双歧杆菌这类跟免疫功能有关的益生菌做作用明显(Depeint et al.,2008)? B

24、i 2muno?必米诺在增强双歧杆菌及提升短链脂肪酸方面比其他来源的益生元更有效。(Tzortzis et al., 2005, Savignac 2013)3.4 两岐双岐杆菌NCIMB 41171来源的§ -半乳糖甘酶生产低聚半乳糖的优势3.4.1 来源优势克拉萨多公司申请的 BbgIV 3 -半乳糖甘酶仅用于生产本公司的产品Bimuno ?必米诺(低聚半乳糖)，且本公司生产的 Bimuno ?(低聚半乳糖)已在欧盟、美国、澳大利亚和新西兰、韩国 等国家广泛应用，被批准用在婴幼儿食品及各类食品和膳食补充剂中。克拉萨多配料有限公司(克拉萨多)出品的低聚半乳糖生产过程中使用的酶制剂B

25、bgIV 3 -半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌NCIMB 41171 (B. bifidum strain, NCIMB 41171 ), 该菌株来自于人类健康志愿者(Tzortzis et al., 2005),属于双歧杆菌菌属。不同菌种来源生产的3 -半乳糖昔酶作为酶制剂生产得到的低聚半乳糖产品，其功效性也有很大的不同。双歧杆菌是肠道益生菌，有维护肠道正常细菌菌群平衡、抑制病原菌的生长，防止便秘，腹泻和胃肠障碍等功效；此外还可改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率，增强人体免疫机能。低聚半乳糖等低聚糖的益生元作用，可以刺激双岐杆菌等有益菌的生产，调节人体肠道内菌群平衡，从而协助名t持基体健康。De

26、sjardins & Roy, 1990 研究发现， 双岐杆菌比其他任何肠道微生物表达高含量的B -半乳糖甘酶Desjardins & Roy, 1990,这一发现同样得到了 Tochikura et al., 1986的实验证实，从不同双岐杆菌中也分离出,半乳糖甘酶Tochikura etal., 1986。大量研究表明从双岐杆菌来源的B-半乳糖甘酶具有乳糖酶的作用，可以水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖(Ward et al. 2007),但是其中来自于 GH42种属双歧杆菌来源的p -半乳糖甘 酶，更倾向于水解低聚半乳糖而非乳糖，这主要是因为其展示的是来自于青春双歧杆菌 DSM2

27、0083van Laere et al., 2000。双歧杆菌菌株中同一细胞内存在的B-半乳糖甘酶的不同活性，能够使它们通过协同工作更好的利于半乳糖寡糖混合物。低聚半乳糖是乳糖产生的混合物，由 2个到8个单糖聚合组 成，一个糖单位的末端是葡萄糖，剩余的糖聚末端是半乳糖，或者由两个半乳糖组成的二聚 糖，优势催化合成所使用的酶是B-半乳糖甘酶。在合成过程中，低聚糖合成的量和性质与酶的催化转移活性和水解性的比例有关，其比例又与酶的来源、浓度、底物特性和反应环境有 关(pH ,温度和时间)。通常原则是在高乳糖浓度、反应温度提高和低水活性下转移酶活性强。酶的来源直接影响着生产低聚半乳糖的半乳糖昔键的类型

28、，(Playne et al., 2002),同时与设定合成反应的pH范围和温度有关。最理想的生产低聚半乳糖的B -半乳糖甘酶的来源是基于菌种水平严格选择的益生菌，这 具有很好的合理性和安全性。使用来源于不同益生菌的B -半乳糖甘酶的基本原理是：酶的起源，对终产品低聚半乳糖 的组分以及功效都非常重要。来源于益生菌的3 -半乳糖甘酶从乳糖中催化合成的低聚半乳糖产品，更容易被B -半乳糖甘酶来源的益生菌进行代谢，引起益生菌对益生元物质更高的选择 性(Rabiu et al., 2001)。根据控制乳糖转变成低聚半乳糖的速率，选择合适的底物浓度，温度，时间， pH,可以 控制产生的低聚糖的聚合度，以

29、更好的符合双岐杆菌利用的要求。因此本公司利用从NCIMB 41171两岐双岐杆菌来源的§ -半乳糖甘酶生产低聚半乳糖(Bimuno ? GOS ),且Bimuno ? GOS已经允许在欧盟、美国、澳大利亚、新西兰、韩国 等国家广泛销售。基于两歧双歧杆菌的功效，其也作为益生菌被广泛使用。止匕外，研究发现，两岐双岐杆菌是通过母乳喂养的健康婴儿肠道的主要菌群，但是在患 有过敏性皮炎的婴儿体内缺乏(Ouwehand et al., 2001)。克拉萨多公司用于生产B -半乳糖甘 酶的两歧双岐杆菌B. bifidum strain, NCIMB 41171,来源于健康人的志愿者(Tzortzi

30、s et al.,2005)。3.4.2 临床功效优势低浓度下针对双歧杆菌高效作用(Depeint et al., 2008)针对双歧杆菌作用最明显，所需要浓度最低的益生元产品(Depeint et al., 2008)选择性作用于双歧杆菌、乳酸菌等提升免疫力的益生菌(Tzortzis et al., 2005)唯一经过临床验证具有“抗粘附”作用的益生元产品，高效作用于肠胃不适症。快速去除病原体，包括沙门氏菌 (Searle et al., 2009)可直接针对 旧S,旅行中腹泻和年龄老化免疫系统下降作用进行宣称。对旧S,肠易激综合症可以宣称(Silk et al., 2009)对旅行中腹泻可

31、以进行宣称(Drakoularakou et al., 2010)对老年人免疫系统提升可以宣称(提升肠道菌群)(Vulevic et al., 2008)提升跟免疫系统有关的肠道菌群(Vulevic et al., 2013)跟其他益生元相比，以两岐双岐杆菌 NCIMB 41171来源的B-半乳糖甘酶生产的低聚半乳 糖必米诺拥有超越益生元以外的优势。Prebiotic Effect靛生无功效必米诺BRmuno®其他GOSFOSGut HealtMprebiQt©此道他康© ©© ©© ©Bilidoccnic Ef

32、feci双岐杆菌功效© ©©Side effects 副作用gGut function (diarrhoea, constipaitiion eic.Ji 顺道功效f腹泻，便秘，其他1©Other Functionality其他功效Bi2muno 画Other GOSFOSAnthinflammation *汇究© ©?Immune regulationLf'i©?Colonic health ppiEihelium)结肠健.康© ©?©Anti*Ad hesioni?i 粘阳©

33、; ©&Processing stability艺稔定性© ©© ©Storage stability (acidic nriiairiK)f诂力二电定 性(室温)©©0为半乳糖甘酶第四部分：质量规格要求、生产使用工艺和检 验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关 情况说明四、食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法。食品添加剂中 该添加剂的检验方法或者相关情况说明4.1质量规格要求1.1生产工艺BbglV伊半乳糖甘酶是以两岐双岐杆菌 NCIMB 41171为原料，通过培养、过滤和纯化过程生 产，所有生产Bb

34、glV伊半乳糖甘酶过程中所使用的原料和添加剂均符合欧盟、美国以及中国法规要求，并严格遵照良好操作规范 GMP要求生产。2.1 技术要求2.1.1 感官指标：应符合表1的规定。表1感官指标项目指标检验方法色泽白色到棕色取适量试样置于洁净的玻性状粉末璃器皿中，在自然光下，观在溶液中外观清澈察具色泽、性状、杂质，透杂质无外来杂质或异物明度2.1.2 理化指标：应符合表2的规定。表2理化指标项目指标检验方法伊半乳糖甘酶活性（U/g dw）>12,000分析程序G960P, BbgIVGalactosidase AssaypH （1%水溶液）6.5 to 7.5pH计铅（以 pb 计）/（mg/k

35、g）3GB 5009.12 »法总碑(以 As 计)/(mg/kg)<1GB/T5009.11 »法2.1.3微生物指标：应符合表 3的规定。表3微生物指标项目指标检验方法菌落总数(CFU/g)<50,000GB 4789.2大肠菌群(CFU/g)<10GB/T 4789.3沙门氏菌(25 g)不得检出GB 4789.4大肠杆菌(25 g)不得检出GB/T 4789.38附录A检验方法A.1试验目的建立和验证一项生物催化剂G960P酶活的测定实验。A.2酶活性的测定A.2.1方法概要此方法通过如下实验验证：使用不同批次的葡萄糖分析试剂构建标准品曲线，并通过

36、酶浓度曲线确定该试验的线性范围。该标准品曲线在不同批次的葡萄糖分析试剂间具很好的重复性。可用G960P (批号No.101332644 )构建的酶浓度曲线来判定实验的线性范围。线性范围在0.35-0.9之间是可信的。使用两个批次的可食用乳糖底物来测定G960P (批号No.101332644 ),用来判断在使用不同批次底物时对实验再现性的影响。在两个不同批次乳糖底物之间试验可重复。G960P ,并编成一一旦该实验被验证并可重复，即使用改进过的试验分析六个不同批次的 个新旧实验对比的总结表。以前应用的方法分析的 G960P三个批次浓度分别为15687, 17488 and 18519U/g ,现

37、在的新方法测定的数据则分别为12178, 15762 and 15877U/g 。A.2.2试剂和材料G960P最终测定水必须使用试剂级别（RG级），除非有另外的特殊规定。A.2.2.1 1.5% w/v缓冲液（保质期6个月）溶解一水合柠檬酸75mg （终浓度0.075% ）和柠檬酸三钠1.425g （终浓度1.425%）到90mL 水中。用容量瓶定容至100mL。A.2.2.2 酶溶液（10mg/ml ）（每日配制）用水配制浓度为10mg/ml的G960P溶液，水合3小时。之后用水稀释至1/70并立即分析。所有的酶样品在分析时必须稀释到适宜浓度，使受试样品和总背景值吸光度差异在0.35-0.

38、9之间。A.2.2.3 27.3 w/v乳糖溶液（每日新鲜制备）称取15g可食用乳糖（一水合乳糖，BDH Cat.No 101394S ）至一个干净的500mL Duran瓶中，加入约40mL沸水。拧上盖子（不要拧紧）以减少蒸汽损失。使用热力搅拌仪重新加热并搅拌，以使乳糖彻底溶解（保持溶液50c以防止结晶析出）。一旦乳糖溶液冷却到50 C,用容量瓶定容至50mL,并加入5mL缓冲液。调节pH至6.5 （+/-0.2）。 A.2.3仪器和设备A.2.3.1葡萄糖测定试剂盒（sigma G-3293 ）-每日新鲜制备将小瓶内容物用20mL水重新溶解（充分溶解），并转移至50mL容量瓶中。用另外20

39、ml水冲洗小瓶并转移至容量瓶中。用水定容至 50mL ,轻轻颠倒混匀-不要震荡-24小时之内使用A.2.3.2分光光度计A.2.4分析步骤测试1测试2乳糖溶液4mL4mL50 c预先孵育5min酶溶液1mL1mL孵育5min放入沸水浴5min以终止反应。快速转移是基本要求，延迟会导致反应变化。冰浴5min设置分光光度计波长为340nm , 25 C：用水调零放入如下比色杯：试剂样品测试1测试2葡萄糖分析试剂3 mL-3 mL3 mL水0.1 mL3 mL-酶反应混合物-0.1 mL0.1 mL0.1 mL立即加入酶，25 c孵育15min后读取A340 nm的吸光率A.2.5结果计算U/g =

40、 （A 340 Test34。Total Blank） x 5（上） x 3.1 x DF x 1000E x 6.22 x 1 x 0.1 x 5（下）=（A 340 Test 小340Total Blank） x 4984 x DFE其中5 （上）=孵育过程中总体积Total Blank=样品+试剂体积3.1=比色杯的总容积DF=稀释系数6.22=3 NAD衽340nm的毫摩尔消光系数1 =孵育过程中使用的酶的体积0.1=比色杯中酶的体积5 （下）=孵育时间E=酶浓度（mg/ mL ）单位定义：一个单位的酶其活性定义为50C、pH6.5时从乳糖释放出一毫摩葡萄糖所需要的酶的量。A.2.6结

41、果A.2.6.1葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线用以下标准品来建立：1.25mg/ mL , 1mg/ mL , 0.5mg/ mL , 0.25mg/ mL &0.125mg/ mL 。这些数据为使用两批不同批号的葡萄糖分析试剂所证明（ Batch number SLBG1067V & Batch number SLBC4940 ）。图1中可见标准曲线在两批葡萄糖分析试剂中得到 很好的重复性。Glucose Standard Curve2.5 SLBG4940 SLBG1067V O 2 5 1AOL a xueffiravuo寸0.511.522.5mg/ml Glucose图

42、1.两个批号的葡萄糖分析试剂相对照的葡萄糖标准曲线A.2.6.2 使用G960P Batch Number 114332051测定实验的线性范围G960P (Batch Number 114332051)在酶浓度范围为 0.1-0.25mg/ml时进行测试，结果见F图2. G960P (Batch Number 114332051)浓度曲线基于以上结果，显示实验的线性范围是吸光率范围为0.360-0.900 (Test-Total Blank )A.2.6.3 G960P实验在不同时间再现的测试表2显示了 2个不同日期测定的G960P (0.143mg/ml )的活性。这结果说明该实验对于同一

43、个操作者在2个不同日期是可重复的。表2:不同日期测定的 G960P (Batch Number 114332051)的活性Date of AssayActivity U/g12/01/1413714.713/01/1413825.1BDH 分类号.No 101394S ）测定的G960P （批号A.2.6.4 使用不同批次底物测试G960P分析的可重复性表3展示了使用两个批次的可食用乳糖(114332051 ,浓度 0.143mg/ml ）的活性表3.使用不同批次乳糖底物时测定的G960P活性Batch number of edible lactoseG960P Activity (U/g)1

44、3513K078001113710.8不同批次底物间实验具可重复性。A.2.6.5批次间稳定重复性和G960P的多个批次对比表4.强调批次间的可重复性。Final assayPrevious assayBatch NumberU/g8133341112178156879133260615762174881013326441587718519101332733158911013327301578712133287513802114330511371311433087121672143312914652A.2.6.6讨论和建议G960P检测新方法被成功验证，在不同批次、底

45、物、酶和葡萄糖试剂间具有稳定可重复性3.1 质量规格编制说明3.1.1 、标准制定的意义BbglV伊半乳糖甘酶来源于两岐双岐杆菌NCIMB 4117 ,主要用来催化合成低聚半乳糖,低聚半乳糖作为益生元物质在全球范围内各种食品中得到广泛使用，我国也已批准低聚半乳糖允许用在婴幼儿食品中，新资源食品也已批准低聚半乳糖作为食品原料广泛用在食品中。我国也已经批准3 -半乳糖甘酶作为食品工业用酶制剂，GB2760-2011中规定允许用的B -半乳糖甘酶的来源有胞壁克鲁维酵母，黑曲酶，米曲霉，鲁克茹维酵母。来源于两岐双岐杆菌NCIMB 4117的BbglV伊半乳糖甘酶生产的低聚半乳糖已经在美国、欧盟、澳新、

46、韩国等多个国家使用，其生产 的低聚半乳糖更容易被双岐杆菌所利用，因此申报由两岐双岐杆菌 NCIMB 4117来源的BbglV §-半乳糖甘酶作为酶制剂并建立3 -半乳糖普酶的质量标准具有重要的意义。3.1.2 、标准编制依据和主要内容我国已经颁布制定了食品安全国家标准食品工业用酶制剂(GB 25594-2010)相关标准，在该标准中规定了污染物和微生物限量指标。本标准主要参照我国食品工业用酶制剂标准规定了相 关安全指标，均符合我国食品工业用酶制剂标准安全指标。3.1.3 与国际上相关标准对比目前，国际上还没有以两歧双歧杆菌为来源的伊半乳糖甘酶产品的相关标准，因此没法做对比。3.1.4 检验方法的验证情况克拉萨多公司用两岐双岐杆菌NCIMB 4117来源的BbgIV伊半乳糖甘酶生产的低聚半乳糖