从组织器官分离细胞

1、精品文档从组织器官分离细胞一、非酶分离细胞方法(一)机械分离法 适用于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、 胸腺、胚胎组织、肿瘤组织等。1.组织研磨法：操作方法：(1)取消毒的碟皿(直径58cm或略大)，放入少许Hanks液或PBS;(2)将采取的小块组织先用PBS漂洗去组织表面的血污，剪成撕 去附带的其它组织，如脂肪或多余的纤维、包膜等，切成5mm3左右 大小的小块，放入碟皿内Hanks液或PBS中；(3)用锋利手术刀或眼科剪将组织剪切成1mm3左右的碎组织块;(4)将碎组织及Hanks液或PBS置于较松的组织研磨匀浆器内， 用手缓慢研磨(可反复几次)，形成散在细胞的匀浆。(5)将组织匀浆经

2、40目或100目不锈钢网过滤去除纤维组织、血 管及较大的凝块。过滤时可用Hanks液或PBS冲洗；(6)将过滤的细胞匀浆悬液直立静置片刻使较大的组织块及红细 胞先沉淀，取上部细胞悬液，以Hanks液或PBS洗涤，离心，收集 细胞；(7)计算活细胞率，计数细胞，制备成所需浓度的细胞悬液。注意：组织研磨匀浆器不能太紧，研磨时应缓慢，否则易使细胞损伤、破碎、或增高死亡细胞率。2.不锈钢网挤压法：精品文档操作方法：(1)将切取的组织块以PBS漂洗去表面血污，切成510mm3的 组织块；(2)在消毒碟皿内放少许Hanks液或PBS,把40目100目的不 锈钢网放入Hanks液或PBS中，将组织块置网上，

3、用消毒注射器芯 或试管的底端轻轻压挤组织，使其穿过网眼入Hanks液或PBS中。同时，用Hanks液或PBS冲洗网上的组织。最后，将网上剩余的纤 维包膜或血管等弃去；(3)收集Hanks液或PBS液中的细胞悬液显微镜检查，如仍有较 多的小组织块，可用更细的不锈钢网(20 wm)重复压挤1次；(4)收集Hanks液或PBS细胞悬液。1000r/min离心片刻使残留较 大组织碎块及红细胞沉淀，吸取未沉淀的细胞悬液。再以Hanks液或PBS洗涤，离心，收集1次；(5)计数活细胞率及计算细胞数，制备所需浓度的细胞悬液。注意：如经1次压挤尚有较多的碎组织块，也可用消毒注射器， 带6号注射针头，将细胞及碎

4、组织从注射器内经针头压出，使细胞再次分散。3.吹打分离法：此法只适用于很松软的组织，如从脑组织分离胶 质细胞。操作方法:(1)取小块脑组织，剥离脑膜，血管等纤维组织后，用Hanks液 漂洗2次；(2)在消毒碟皿中放约23倍于脑组织的Hanks液， 将脑组织置Hanks精品文档液中，用滴管吸取Hanks液反复吹打脑组织使成悬液；(3)将组织悬液经40目尼龙网过滤后，移入试管中直立静放5 10分钟，较大的组织碎块及红细胞下沉，脂肪及碎细胞片等漂浮在 液体上部。吸取中间部分的细胞悬液，并如此反复23次；(4)取少许细胞悬液显微镜检查，如已制成较多的散在细胞悬液， 可计数活细胞率。计数细胞用Hanks

5、液或适当的培养液制备成所需浓 度的细胞悬液。(二)EDTA分离法EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid),是一 种螯合剂(chelatingagent),能与组织内的Ca2+、Mg2+离子螯合而使 细胞分离。EDTA常用PBS等配成0.02%的工作液。具作用温和，在一般情 况下对细胞损伤较小，但分离效果并不很高。可用于分离一些胚胎组 织或肝脏灌流，不过较少单独使用，常和其它一些酶(如0.25%胰蛋 白酶)混合使用(以1：1或2：1混合);但不要与胶原酶混合使用，因 这种酶依赖Ca2+和Mg2+,与EDTA混合后可使胶原酶的消化作用 严重障碍或失效。与胰蛋白酶混合

6、可用于分离培养细胞进行传代培 养。其方法是将培养细胞的培养液吸去后，加入0.02%EDTA与0.25%胰蛋白酶的混合液，以盖满细胞为度，处理310分钟，注意不能消 化过度使细胞收缩脱落。吸出消化液，立即用Hanks液洗涤23次 以洗去EDTA。最后加入培养液，用滴管吹打使细胞脱落形成细胞悬 液。使用EDTA应注意分离时间不能过长。因其对细胞的线粒体可 有损伤，而且细胞长时间处于无Ca2+环境下（被EDTA螯合）则可使 细胞内K+降低;精品文档同时呼吸减弱也可造成细胞损害。（三）其他非酶分离细胞方法甘氨酸（glycine）也可用于分离细胞，如用含1mol/L甘氨酸与2mol/LEDTA的混合液分

7、离海胆胚胎。 双糖（disaccharides）,如高张蔗糖、乳糖、麦芽糖等（常用0.5mol/L）可 分离细胞间的缝隙连接或紧密连接等。0.5%KOH的稀碱溶液（pH9.3左右）也可用于胚胎组织的分离。但如将pH恢复正常，则分散的细胞 又可再聚合。二、酶分离细胞技术可用于分离细胞的酶很多。蛋白水解酶类有胰蛋白酶（trypsin）、胶原酶（collagenases）弹性蛋白酶（elastase）链霉蛋白酶（pronase）溶菌酶（lysozyme）、木瓜蛋白酶（papain）等。其它酶类有透明质酸酶（hyaluronidase）,脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease普。这些酶各有

8、 优缺点，对细胞的损伤也各不相同，所以对使用何种酶应按实验要求 加以选择。比较常用的有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸 酶等。胰蛋白酶适于消化间质较少的组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、 肝、肾等;对纤维性组织的消化能力较差。Ca2+、Mg2+对其活性有抑 制作用，故配制时应不含Ca2+或Mg2+,或与EDTA配伍使用。 胰 蛋白酶的工作浓度为0.01%0.5%,常配成0.25%的工作液。室温及37c下消化比较恰当，4c时仍有缓慢的消化作用。最适工作pH为8 9左右。消化时间最短（如胚胎组织）为2030分钟，一般为3060分钟，低温或低浓度时也可延长至1218小时（过夜）。胶原酶适用于消化分

9、离纤维组织，对上皮、肝、胰、肾及一些癌 组织的细胞分离也比较适用。它有很多类型，Sigma厂的产品有1精品文档V、即、皿、XI等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞或一 般纤维组织，应按实验要求，按产品说明书选用。胶原酶与胰蛋白酶 不同，它必须在Ca2+及Mg2+存在的条件下，才能较好地活化。常用 的浓度为100200U/ml（按说明书配制。一般产品>125U/mg,故 工作浓度常用0.05%0.1%,高纯度胶原酶可为>1200U/mg或10003000U/mg）。该酶的作用缓慢，常需较长的消化时间。链霉蛋白酶为非特异性具有广谱性质的中性蛋白酶， 适于分离消 化

10、道的粘膜上皮细胞及肝脏的Kupffer细胞。其消化速度比胰蛋白酶 快。分离的消化道上皮存活率可高达96%左右，较其它酶优越。透明质酸酶对间质中含多量透明质酸的组织比较适用，对热稳 定，工作pH较宽，常可与其它酶配合使用以增加消化分离细胞的效 果。（一）胰蛋白酶消化分离细胞方法操作方法：1.在消毒碟皿中将组织剪切成35mm3左右的碎组织块；2.在小烧杯内放入3050倍的0.25%胰蛋白酶， 加入剪切碎的组 织，在37c水浴或温箱中消化3060分钟，每隔5分钟左右摇荡1次（用电磁搅拌器拌搅亦可）；3.将消化的组织离心1000r/min10分钟，吸去上清液，以Hanks液漂洗23分钟，再离心，去上清

11、，重复3次以尽量洗去胰蛋白酶；4.用100 wm尼龙网或不锈钢网过滤，去除未消化分离的碎组织 块、纤维等；5.再以Hanks液漂洗，收集细胞悬液；6.计数活细胞百分率，计数细胞数，用含4%小牛血清的PBS或Hanks精品文档液制备所需浓度的细胞悬液（加小牛血清不仅可以作为稳定剂， 抑制分散的细胞凝聚； 也可作为酶抑制剂， 抑制与细胞表面结合的胰 蛋白酶的消化作用） 。（二）胶原酶消化分离细胞方法操作方法：1.将切取的组织先用Hanks液或PBS洗净粘附的血污。在碟皿内 剪切成3 5mm3碎组织块；2.在小培养瓶内加45ml培养液，放入数小块组织碎块，加入 等量0.1%的胶原酶（终浓度约为100U/