X基因工程的基本操作程序PPT学习教案

1、会计学1X基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2 2第1页/共55页3 3第2页/共55页4 4第3页/共55页5 5外显子内含子第4页/共55页6 6结构基因外显子内含子转录、加工修饰成熟mRNA第5页/共55页7 7第6页/共55页8 8从基因文库中提取目的基因1 基因文库(gene library)概念n又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。n基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。第7页/共55页9 9基因文库的分类按

2、照外源DNA片段的来源：u从特定组织提取的染色体基因组DNA -基因组DNA文库（总）umRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。第8页/共55页1010基因组文库部分基因文库第9页/共55页1111u基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因第10页/共55页1212利用PCR提取目的基因PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。原理：DNA双链复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子第11页/共55页1313n模板DNA （已知碱基

3、序列）n 特异性引物（DNA）n耐热DNA聚合酶（Taq酶）n dNTPs （4种脱氧核苷酸）nMg+(促进dNTP与核酸骨架作用)PCR体系基本组成成分第12页/共55页1414PCR的基本反应步骤变性90-95C延伸70-75C退火55-60C第三步：将反应体系升温至7075 ，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸合成，产生一条与模板链互补的DNA链。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至9095 ，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，

4、作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至5560 ，使两种引物分别与模板DNA链配对结合，这个过程称为复性。第13页/共55页151553355335变性第14页/共55页1616533555ABAB退火第15页/共55页1717533555Taq酶延伸1第16页/共55页1818533555延伸2第17页/共55页1919()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20第18页/共55页2020第19页/共55页2121模板DNA95第20页/共55页222250引物1引物2DNA引物第21页/共55页2323引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第

5、22页/共55页242472第1轮结束第2轮开始第23页/共55页2525955072TaqTaqTaqTaq第24页/共55页262672第2轮结束第25页/共55页2727重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 第26页/共55页2828第27页/共55页2929第28页/共55页3030第29页/共55页3131第30页/共55页3232QPCR是针对特定DNA片断的快速体外复制增殖技术Q每循环一轮，目的基因的量可增

6、加一倍Q增殖速率为2n,（n为循环次数） 每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 第31页/共55页3333PCR技术扩增过程a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成 。 b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部 。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的 。 氢键单链DNA双链DNA链第32页/共55页3434第33页/共55页3535质粒DNA分子切口黏性末端切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种 限制酶第34页/共55页3

7、636目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。复制原点插入基因终止子抗生素抗性基因表达载体启动子第35页/共55页3737第36页/共55页3838第37页/共55页3939Ca2处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。第38页/共55页4040第39页/共55页4141DNA分子杂交技术分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因检验目的基因是否转录出了mRNA检验目的基因是否表达出了蛋白质个体生物学检验个体生物学性状观察个体生物学性状观察第40页/共55页424

8、2DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd第41页/共55页4343检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原

9、抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。第42页/共55页4444大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物第43页/共55页4545 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第44页/共55页46461.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是2、下列属于获取目的基因的方法的是利用mRNA反转录形成

10、从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.第45页/共55页47473.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4. 有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料第46页/共55页4848第47页/共55页4949例、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝

11、血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等 于凝血因子氨基酸数目的3倍B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组 DNA分子导入羊的受精卵C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细 胞，而不存在于其他细胞中D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分 子的一条链为模板合成mRNA第48页/共55页5050 尝试设计 第49页/共55页51511.答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使

12、用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。（P15）第50页/共55页52522.解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完

13、全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。 根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区

14、（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。第51页/共55页5353 需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。第52页/共55页54543.解析：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。第53页/共55页55554.解析：基本操作如下：