核酸分离纯化PPT学习教案

1、会计学1核酸分离纯化核酸分离纯化概 述第1页/共42页第2页/共42页造成的机械剪切力等条件都能明显造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性破坏大分子量的线性DNADNA分子，对分子，对于分子量小的环状质粒于分子量小的环状质粒DNADNA及及RNARNA分分子，威胁相对小一些；另外如高温子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在常常在0 044的条件下进行。的条件下进行。（一）保持核酸分子一级结构的完整性第3页/共

2、42页（一）保持核酸分子一级结构的完整性第4页/共42页变性蛋白结合成带负电荷的复合物，变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。该复合物在高盐溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一级结构的完整性第5页/共42页（一）保持核酸分子一级结构的完整性第6页/共42页 使用注意： DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。 容易降解，保存在4或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 剧毒。（一）保持核酸分子一级结构的完整性第7页/共42页（一）保持核酸分子一级结构的完整性第8页/共42页第9页/共42页破碎组织细胞提取纯

3、化I.材料与方法的选择II.破碎细胞或包膜核酸的释放III.核酸分离、纯化IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质V.核酸的鉴定与保存二、分离提取核酸的主要步骤第10页/共42页p整性、产量、纯度和浓度符合实验整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。要求。（一）材料与方法的选择第11页/共42页p整性、产量、纯度和浓度符合实验整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。要求。（一）材料与方法的选择第12页/共42页（二）细胞的破碎核酸的释放第13页/共42页（二）细胞的破碎核酸的释放第14页/共42页注意：1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的提取；2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。（二

4、）细胞的破碎核酸的释放第15页/共42页细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。（三）核酸的分离纯化第16页/共42页（三）核酸的分离纯化第17页/共42页溶解度仍有相当大的溶解度。调溶解度仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使节氯化钠浓度，可使RNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白分步提取开来。核蛋白分步提取开来。核酸核酸- -蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静后，破坏静电吸力，使氢键

5、破坏，核蛋白解电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；聚；核酸分离纯化的基本方法第18页/共42页核酸分离纯化的基本方法第19页/共42页醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。核酸分离纯化的基本方法第20页/共42页在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。核酸分离纯化的基本方法第21页/共42页二酯键。(2(2）安全操作）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意核酸分离纯化的基本方法第22页/共4

6、2页（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第23页/共42页淀的盐，需用淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗洗涤涤去除。去除。（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与一价或二价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA。第24页/共42页（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第25页/共42页浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存第26页/共42页1OD1OD值的吸光度相当于双链值的吸光度相当于双链DNADNA浓浓度为度为50g/ml50g/ml；单链；单链DN

7、ADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。浓度鉴定（五）核酸的鉴定与保存第27页/共42页第28页/共42页标准对照，可比较出被测标准对照，可比较出被测DNADNA溶溶液浓度。液浓度。注意：注意：此法的比较主要基于目测，此法的比较主要基于目测，是估计水平。是估计水平。（五）核酸的鉴定与保存EB与DNA的结合浓度鉴定第29页/共42页纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存第30页/共42页纯度鉴定（五）核酸的鉴定与保存判断核酸样品的纯度： DNA纯品: OD260/OD280 RNA纯品: OD260/OD280 比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（

8、270）比值升高：DNA变性、RNA污染混合污染：比值正常第31页/共42页（五）核酸的鉴定与保存纯度鉴定第32页/共42页n泳图呈拖尾状。泳图呈拖尾状。 完整性鉴定（五）核酸的鉴定与保存第33页/共42页DNA的降解（五）核酸的鉴定与保存第34页/共42页（五）核酸的鉴定与保存 完整性鉴定第35页/共42页（五）核酸的鉴定与保存第36页/共42页核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4样品经常使用-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存,避免反复冻融保存介质：灭菌水TE缓冲溶液(最常用)：（五）核酸的鉴定与保存2. 核酸的保存DNA的保存第37页/共42页（五）核酸的鉴定与保存2. 核酸的保存DNA的保存第38页/共42页RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70保存长期保存可以沉淀形式