酶的催化机制.

1、第四章第四章 酶的催化机制酶的催化机制l酶分子在一级结构的基础上盘绕折叠成酶分子在一级结构的基础上盘绕折叠成特定的空间结构（即三维结构）才具特特定的空间结构（即三维结构）才具特定的催化功能。其中包括二级结构（主定的催化功能。其中包括二级结构（主链碳原子局部空间排列，即链碳原子局部空间排列，即a螺旋、螺旋、折折叠和叠和转角），三级结构（在三维空间转角），三级结构（在三维空间中折叠成紧密的近球状结构）和四级结中折叠成紧密的近球状结构）和四级结构（寡聚酶的亚基之间的相互结合）。构（寡聚酶的亚基之间的相互结合）。 l酶的高效率、高度专一性和酶活可调节酶的高效率、高度专一性和酶活可调节等催化特性，都与酶

2、蛋白本身的结构直等催化特性，都与酶蛋白本身的结构直接相关，酶蛋白的一级结构决定酶的空接相关，酶蛋白的一级结构决定酶的空间构象，而酶的特定空间构象是其生物间构象，而酶的特定空间构象是其生物功能的结构基础。功能的结构基础。l人们只有更深入地认识酶、才能更好地人们只有更深入地认识酶、才能更好地控制酶和应用酶，即在不断研究酶的结控制酶和应用酶，即在不断研究酶的结构和功能的具体关系和催化机理的基础构和功能的具体关系和催化机理的基础上，才能研制新的酶类，开发出更广泛上，才能研制新的酶类，开发出更广泛的用途。的用途。第一节第一节 酶的活性部位（活性中心）酶的活性部位（活性中心）l酶的活性部位是指酶分子中结合

3、底物并酶的活性部位是指酶分子中结合底物并催化底物转化成产物的区域。催化底物转化成产物的区域。活性部位活性部位包括底物的包括底物的结合部位结合部位和和催化部位催化部位。参与。参与底物结合的氨基酸残基称为结合基团，底物结合的氨基酸残基称为结合基团，直接参与催化过程的基团称为催化基团，直接参与催化过程的基团称为催化基团，这些氨基酸残基在一级结构可能相距很这些氨基酸残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构中却相距很近，处于远，但在空间结构中却相距很近，处于酶分子的表面并组成一个裂隙和流水口酶分子的表面并组成一个裂隙和流水口袋。袋。 l一、活性部位在整个一、活性部位在整个酶分子中只占很小一酶分子中只占很

4、小一部分部分l酶与其他蛋白质一样，酶与其他蛋白质一样，是一个结构极其复杂是一个结构极其复杂的大分子，而参与底的大分子，而参与底物结合和催化的基团，物结合和催化的基团，则只是少数几个氨基则只是少数几个氨基酸残基。作为活性部酸残基。作为活性部位的裂隙只占酶分子位的裂隙只占酶分子中很小的一部分。中很小的一部分。 l二、二、 活性部位是具有三维结构的裂隙活性部位是具有三维结构的裂隙l l酶的活性部位具有复杂三维结构的形态，酶的活性部位具有复杂三维结构的形态，构成活性部位的氨基酸残基处于酶分子构成活性部位的氨基酸残基处于酶分子一级结构上的不同部位，有的残基相距一级结构上的不同部位，有的残基相距很远，然而

5、在空间结构上却相距很近，很远，然而在空间结构上却相距很近，可协同结合和催化底物。可协同结合和催化底物。l例如溶菌酶分子中有例如溶菌酶分子中有129个氨基酸残基，个氨基酸残基，活性部位的重要基团则是由活性部位的重要基团则是由Glu35，Asp52，Trp62，Trp63和和Asp101残基提残基提供的。供的。l三、底物与酶活性部位是通过次级三、底物与酶活性部位是通过次级键结合的键结合的 l酶与底物的复合物酶与底物的复合物ES的平衡常数在的平衡常数在10-210-8molL的范围内，其相互作用的的范围内，其相互作用的自由能变化相当于自由能变化相当于-3-12kcalmol的范的范围。我们知道，共价

6、键的自由能变化在围。我们知道，共价键的自由能变化在-50-110kcalmol的范围内，相比之下，的范围内，相比之下，底物与酶的结合力是很弱的。底物与酶的结合力是很弱的。l四、活性部位的裂隙具有高度疏水性四、活性部位的裂隙具有高度疏水性 l在已知结构的酶分子中，与底物分子结合在已知结构的酶分子中，与底物分子结合的活性部位裂隙，通常水分子是进不去的，的活性部位裂隙，通常水分子是进不去的，除非水分子本身是底物分子。裂隙中也含除非水分子本身是底物分子。裂隙中也含有几个对结合和催化来说是必需的极性残有几个对结合和催化来说是必需的极性残基，但并不影响整个裂隙的疏水性，因此基，但并不影响整个裂隙的疏水性，

7、因此有人将活性部位形象地称之为有人将活性部位形象地称之为“疏水口疏水口袋袋”，活性部位的疏水性增进了底物的结，活性部位的疏水性增进了底物的结合，是酶具有高效率的原因之一。参与底合，是酶具有高效率的原因之一。参与底物结合的基团总和称为结合部位，参与催物结合的基团总和称为结合部位，参与催化过程的基团总和称为催化部位。实际上化过程的基团总和称为催化部位。实际上这两个部位的几何位置并不截然分开，采这两个部位的几何位置并不截然分开，采用这两个名称只是为了便于说明作用的机用这两个名称只是为了便于说明作用的机制。制。l五、五、 活性部位构象上的柔性活性部位构象上的柔性 l酶催化的专一性取决于酶分子活性部位必

8、需基团各酶催化的专一性取决于酶分子活性部位必需基团各原子的空间排布以及酶与底物之间的多点结合。原子的空间排布以及酶与底物之间的多点结合。1890年年Fisher曾提出酶和底物相互作用的曾提出酶和底物相互作用的锁一匙模锁一匙模型型，然而后来研究结果表明，酶的活性部位并不是，然而后来研究结果表明，酶的活性部位并不是刚性不变的，在结合底物时酶分子的活性部位构象刚性不变的，在结合底物时酶分子的活性部位构象发生了改变，这个过程是个动态的过程，称为发生了改变，这个过程是个动态的过程，称为诱导诱导契合契合。近年来，基于大量的在去折叠过程中失活与。近年来，基于大量的在去折叠过程中失活与构象变化的比较研究的重要

9、事实，我国科学家邹承构象变化的比较研究的重要事实，我国科学家邹承鲁提出了酶分子的活性部位柔性的理论，并指出这鲁提出了酶分子的活性部位柔性的理论，并指出这种柔性是酶催化作用所必需的。也就是说，酶分子种柔性是酶催化作用所必需的。也就是说，酶分子的活性部位构象上相对的柔性是酶催化所必需的。的活性部位构象上相对的柔性是酶催化所必需的。第二节第二节 酶的活性部位的研究方法酶的活性部位的研究方法l一、发现与证实一、发现与证实lChTChT（胰凝乳蛋白酶）（胰凝乳蛋白酶）241241个氨基酸，分子量个氨基酸，分子量2570025700。此酶可。此酶可水解芳香族氨基酸的羧基端形水解芳香族氨基酸的羧基端形成的成

10、的肽肽键键；可水解芳香族氨基酸的羧基端形可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的成的酯酯键。键。l设计人造底物设计人造底物乙酰酪氨酸乙酯。由于底乙酰酪氨酸乙酯。由于底物很小，故它与酶只是点接触，而酶又能使物很小，故它与酶只是点接触，而酶又能使其水解，说明酶分子直接参与酶催化的部位其水解，说明酶分子直接参与酶催化的部位只不过是一小部分。只不过是一小部分。l溶菌酶溶菌酶129129个氨个氨基酸，分子量基酸，分子量1460014600。水解细。水解细胞壁（多糖）胞壁（多糖）而溶菌酶直接而溶菌酶直接接触的只是六接触的只是六个六碳糖，也个六碳糖，也说明酶分子只说明酶分子只有小部分参与有小部分参与作用。作用。lI

11、（抑制剂）（抑制剂）二异丙基氟磷（二异丙基氟磷（DFP）lChT + DEP 活性丧失活性丧失l经测定经测定DEP与与ChT的的195位位Ser结合，而结合，而ChT有有27个个Ser，只与只与195-Ser结合，可见此结合，可见此Ser与其它与其它Ser性质不同，可能性质不同，可能处于特殊部位。处于特殊部位。lChT酶原与酶原与ChT结构很相近，但结构很相近，但DEP + ChT酶原酶原不结不结合合l不结合者无酶活，可以推测抑制剂结合的部位可能是活不结合者无酶活，可以推测抑制剂结合的部位可能是活性中心性中心l二、活性部位含义二、活性部位含义 l酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分酶的活性部

12、位是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。子中与底物结合并催化反应的场所。l活性部位是由几个氨基酸侧链基团组成（包活性部位是由几个氨基酸侧链基团组成（包括辅酶、金属离子等），它们在一级结构中括辅酶、金属离子等），它们在一级结构中位置可能很远，但形成空间结构后位置很近，位置可能很远，但形成空间结构后位置很近，活性部位实质上是某一空间区域而不是一个活性部位实质上是某一空间区域而不是一个点或面。点或面。l酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。l羧肽酶羧肽酶A（全酶）活性部位：（全酶）活性部位：Tyr，Arg，Glu；Zn+。l三、催化部位和

13、结合部位三、催化部位和结合部位 l催化部位是催化反应中直接参与电子授受关系催化部位是催化反应中直接参与电子授受关系的部位，经研究的部位，经研究ChT的催化部位已清楚，其电的催化部位已清楚，其电荷传递系统为荷传递系统为Asp102 His57Ser195（*一一级结构较远但空间位置较近）级结构较远但空间位置较近）l而而T（胰蛋白酶）具有与（胰蛋白酶）具有与ChT相同的催化部位。相同的催化部位。lChT Gly障碍小，故芳香族氨基酸易进入，因障碍小，故芳香族氨基酸易进入，因此水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键此水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键lT Asp-则易结合带正电的氨基酸，故水解碱性则易结合带正电

14、的氨基酸，故水解碱性氨基酸羧基形成的肽键氨基酸羧基形成的肽键l酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，即二者结合部位不同。即二者结合部位不同。 l四、酶活性部位的研究四、酶活性部位的研究 l主要方法是主要方法是化学修饰法化学修饰法，其它方法包括，其它方法包括反应动力学法、光谱法、反应动力学法、光谱法、X光衍射法（结光衍射法（结果可靠，但必须是晶体）。果可靠，但必须是晶体）。l化学修饰法化学修饰法：l蛋白质蛋白质+化学试剂化学试剂反应反应引起某些引起某些氨基酸残基或某些基团的共价的化学改氨基酸残基或某些基团的共价的化学改变即化学修饰。此化学试剂叫化学修饰变

15、即化学修饰。此化学试剂叫化学修饰剂。剂。l如何确定修饰试剂是结合在活性部位的如何确定修饰试剂是结合在活性部位的基团上，而不是结合到活性部位以外的基团上，而不是结合到活性部位以外的基团上呢？首先要求加入修饰试剂后，基团上呢？首先要求加入修饰试剂后，酶计量失活（平行失活），其次还要根酶计量失活（平行失活），其次还要根据不同的情况作进一步确定。据不同的情况作进一步确定。l计量失活：加入几摩尔修饰剂就有几摩计量失活：加入几摩尔修饰剂就有几摩尔的酶尔的酶100%失活。失活。l特殊基团特殊基团非特异性试剂非特异性试剂 l使用此种试剂要求使用此种试剂要求:l Y只能在活性部位中有，其它部位没有。只能在活性部

16、位中有，其它部位没有。l例：木瓜蛋白酶有例：木瓜蛋白酶有7个个Cys，其中，其中6个形成个形成-S-S-；1个个Cys。lCys+碘乙酸碘乙酸 计量失活计量失活 l故故Cys在活性部位上。在活性部位上。l活性部位活性部位Y，由于活性部位微环境的影响反应灵，由于活性部位微环境的影响反应灵敏度极高，此时非活性中心的敏度极高，此时非活性中心的Y不与不与R结合。结合。l例：例：RNA酶活性部位酶活性部位Lys41的的-NH2活性特强，可活性特强，可被氟二硝基苯特异标记。被氟二硝基苯特异标记。l具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特具有上述二条件的酶极少，而我们要使用非特异性试剂就必须用差示标记法。异

17、性试剂就必须用差示标记法。l差示标记法差示标记法（加入保护剂）（加入保护剂）l非特殊基团非特殊基团非特异性试剂非特异性试剂lR* 连接的基团即活性部位。连接的基团即活性部位。l保护效果：在保护过程中要避免下述两点保护效果：在保护过程中要避免下述两点:lP要过量，防止剩余未被保护的要过量，防止剩余未被保护的Y；保护后构；保护后构象变化导致象变化导致Y-R解离。上述两点可导致实验误解离。上述两点可导致实验误差。前两种标记均为共价标记。差。前两种标记均为共价标记。l亲和标记法亲和标记法l非特殊基团非特殊基团亲和试剂亲和试剂l根据酶和底物的结合特性来设计底物即特根据酶和底物的结合特性来设计底物即特异性

18、试剂。异性试剂。l底物底物+可与活性部位结合的活性基团可与活性部位结合的活性基团亲亲和试剂（特异性较强）和试剂（特异性较强）lChTChT：水解芳香族氨基酸羧基所形成的肽：水解芳香族氨基酸羧基所形成的肽键或酯键，故亲和试剂为甲苯磺酰键或酯键，故亲和试剂为甲苯磺酰- -L-L-苯苯丙氨酸为基本结构。丙氨酸为基本结构。lChT酶原酶原+TPCK不结合不结合lChT+8M脲脲+TPCK不结合不结合lChT+TPCK结合结合lTPCK结合部位必定是活性中心结合部位必定是活性中心lChT：有两个：有两个His残基，一级结构的残基，一级结构的40，57位。位。lChT+TPCK 酶水解酶水解分析氨基酸组成

19、分析氨基酸组成只有一个只有一个His 确定确定TPCK结合的是另一结合的是另一His。l14C-TPCK+ChT水解水解发现发现14C存在于存在于His-57上，上，确定确定TPCK与第与第57位的位的His结合（即活性部位）结合（即活性部位）lT（胰蛋白酶）也有（胰蛋白酶）也有His，但不与，但不与TPCK结合，说明结合，说明T与与ChT有不同的底物专一性，有不同的底物专一性，T水解碱性氨基酸羧基所形成的酰胺键或水解碱性氨基酸羧基所形成的酰胺键或酯键。它的底物是甲苯磺酰酯键。它的底物是甲苯磺酰- -L-L-赖氨酰胺赖氨酰胺（酯）（酯） lTLCK+T，最后找出与，最后找出与TLCK结合的氨结

20、合的氨基酸是基酸是His-46即活性部位。即活性部位。 l其它方法：其它方法：l动力学分析法动力学分析法：若在不同的：若在不同的pH条件下，酶条件下，酶活力变化较大，而某个基团的解离程度也有活力变化较大，而某个基团的解离程度也有较大程度的改变，则此基团是活性部位。较大程度的改变，则此基团是活性部位。l光谱学法光谱学法：最常用的紫外吸收光谱和荧光光：最常用的紫外吸收光谱和荧光光谱。谱。l蛋白质分子中含有生色基团，当底物结合时，蛋白质分子中含有生色基团，当底物结合时，位于结合部位的生色基团必然会发生某种变位于结合部位的生色基团必然会发生某种变化，比较底物结合前后光谱学的变化，可推化，比较底物结合前

21、后光谱学的变化，可推断活性部位。断活性部位。lX光衍射光衍射：X光衍射可直接看出活性部位光衍射可直接看出活性部位（即底物结合部位），但必须是结晶。（即底物结合部位），但必须是结晶。 第三节第三节 酶的催化机制酶的催化机制l我们已经了解到酶之所以能加速化学反应，我们已经了解到酶之所以能加速化学反应，主要是酶能通过与底物形成中间产物来降主要是酶能通过与底物形成中间产物来降低反应的活化能。不同的酶其催化机制是低反应的活化能。不同的酶其催化机制是有差别的，下面讨论酶的催化机制和对酶有差别的，下面讨论酶的催化机制和对酶高效催化有贡献的主要因素高效催化有贡献的主要因素。l1、底物与酶的接近与定向效应、底物

22、与酶的接近与定向效应l底物的反应基团与酶活性中心的催化基底物的反应基团与酶活性中心的催化基团相互严格的定向，使得活性中心的底团相互严格的定向，使得活性中心的底物浓度特别高从而使反应速度增高。研物浓度特别高从而使反应速度增高。研究发现提高酶反应速度的最主要方法是究发现提高酶反应速度的最主要方法是使底物分子进入酶的活性中心区域，亦使底物分子进入酶的活性中心区域，亦即大大提高活性中心区域的底物有效浓即大大提高活性中心区域的底物有效浓度。除此之外，还需要使反应的基团在度。除此之外，还需要使反应的基团在反应中彼此相互严格地反应中彼此相互严格地“定向定向”，反应，反应物分子才被作用，迅速形成过渡态。见物分

23、子才被作用，迅速形成过渡态。见轨道定向假设示意图。轨道定向假设示意图。 l2、底物分子的敏感键产生张力或变形、底物分子的敏感键产生张力或变形l许多酶的活性部位开始与底物并不相适许多酶的活性部位开始与底物并不相适应，但为了结合底物，酶的活性部位不应，但为了结合底物，酶的活性部位不得不发生相应变化（前面所提的诱导契得不发生相应变化（前面所提的诱导契合），以适应底物。一旦与底物结合，合），以适应底物。一旦与底物结合，酶分子中某些基团可使底物分子的敏感酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中电子云密度部分的增加或减少从而键中电子云密度部分的增加或减少从而产生产生“电磁张力电磁张力”使底物发生变形，使使底

24、物发生变形，使底物敏感键更敏感，更易于反应。下图底物敏感键更敏感，更易于反应。下图用一个示意图说明酶与底物结合，使底用一个示意图说明酶与底物结合，使底物变形生成产物的过程。物变形生成产物的过程。l3、共价催化作用、共价催化作用 l某些酶能与底物形成一个反应活性很高的共某些酶能与底物形成一个反应活性很高的共价中间复合物。底物只需越过较低的活化能价中间复合物。底物只需越过较低的活化能就可以形成产物。此既为共价催化作用。就可以形成产物。此既为共价催化作用。l共价催化的最一般的形式是催化剂的亲核基共价催化的最一般的形式是催化剂的亲核基团对底物中亲电子的碳原子进行攻击，亲核团对底物中亲电子的碳原子进行攻

25、击，亲核基团含有多电子的原子，可以提供电子，它基团含有多电子的原子，可以提供电子，它是十分有效的催化剂。酶反应中可以进行共是十分有效的催化剂。酶反应中可以进行共价催化的、强有力的亲核基团很多，酶蛋白价催化的、强有力的亲核基团很多，酶蛋白分子上至少就有三种，图中所指出的丝氨酸分子上至少就有三种，图中所指出的丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基及组氨酸的咪唑基。此羟基、半胱氨酸巯基及组氨酸的咪唑基。此外对具辅酶的双成分酶（复合蛋白质）来讲，外对具辅酶的双成分酶（复合蛋白质）来讲，其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。其辅酶中往往还含有另外一些亲核中心。l4、酸碱催化、酸碱催化l这里指的是广义的酸碱催化。它是一种

26、质子这里指的是广义的酸碱催化。它是一种质子供体及质子受体的催化，发生在细胞内许多供体及质子受体的催化，发生在细胞内许多类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的，类型的有机反应都是受广义的酸碱催化的，如将水加到羰基上、酯的水解，从双键上脱如将水加到羰基上、酯的水解，从双键上脱水、各种分子重排及许多取代反应等。水、各种分子重排及许多取代反应等。l酶活性中心的一些基团（氨基、羧基、酚羟酶活性中心的一些基团（氨基、羧基、酚羟基、巯基、咪唑基等）可作为质子供体或受基、巯基、咪唑基等）可作为质子供体或受体对底物进行催化，从而加快反应速度。蛋体对底物进行催化，从而加快反应速度。蛋白质中可作为广义酸碱的功能基。白

27、质中可作为广义酸碱的功能基。 l其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是其中组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个最有效、最活泼一个很强的亲核基团，又是一个最有效、最活泼的广义酸碱功能基。这是因为组氨酸的咪唑基的的广义酸碱功能基。这是因为组氨酸的咪唑基的解离常数约为解离常数约为6.0，接近生物体的生理，接近生物体的生理pH条件，此条件，此时它一半是酸形式、另一半是碱形式，既可以作时它一半是酸形式、另一半是碱形式，既可以作为质子供体、也可作为质子受体，而且研究发现为质子供体、也可作为质子受体，而且研究发现它供出和接受质子的速度十分迅速，在酶的酸碱它供出和接受质子的速度十分迅速，在酶的酸碱催化中显得特