几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白α亚基的研究

1、几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白亚基的研究第30卷第4期2001年12月上悔师范大学(自然科学版)JournalofShanghaiTehersUniveity(NaturalSciences)V0I1.oD200l几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白亚基的研究章骏,袁维佳,许燕(上海师范大学生帝与环境科学学院.上海200234)摘要:报道丁甲壳纲几种常见动物的视网膜为材料,用免疫印迹法验证了长尾类动物罗氏沼虾和日本沼虾的视网膜中具有Gq蛋白的d亚基,Gq抗体在42kDa处识别了一条蛋白条带.短尾粪动物中华域螯蟹的视网膜中没有检测到Gq蛋白的d亚基.同样的方法在罗氏沼虾的眼柄蛋白中没有检测到Gq蛋白的

2、n亚基.不同光照处理罗氏沼虾的复眼.暗适应后视网膜中的Gq蛋白的d亚基含量明显少于光适应状态时其中的Gq蛋白的n亚基含量.美键词:Gqa;视网膜;免疫印迹;罗氏沼虾;日本沼虾;中华缄螯蟹中图分类号:Q513文献标识码:A文章编号:i0005137(2001)040073050引言异源三聚体G蛋白是由a,3个亚基组成的三聚体,它在许多类型的信号转导中起重要作用.G蛋白的类型很多,有激活腺苷酸环化酶的Gs,抑制腺苷酸环化酶的Gi,在脑和心脏中含量丰富的Go以及脊椎动物视觉细胞中的Gt等.J.Gq是最近几年发现的一种G蛋白类型,存在于许多无脊椎动物的视觉细胞中它在动物的光电传导过程中起着重要的介导作

3、用.Gqa的移位被认为是控制感光器敏感度的重要分子机制之一Gq在甲壳纲动物的视觉细胞中也有发现,l993年,TERAKITA用免疫沉淀法标记了螯虾感光器中的Gq蛋白的a亚基J,l998年又用同样的方法研究了螯虾感光器中的Gq蛋白的p亚基,并且分析了它的局部序列J.Gq蛋白是否在甲壳动物的感光器中普遍存在或另有其他形式,还有待做大量研究.在以前的实验中对几种甲壳动物的视网膜蛋白进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现其中有一条分子量为42kDa的蛋白条带存在.这与以往论文中报道的Gq蛋白n亚基的分子量是相同的.本实验用免疫印迹法来进一步确证其感光器中Gq蛋白的存在,并通过不同光照处理来研究其

4、是否与光电传导有关,为无脊椎动物的感光机理提供资料.收稿日期:2001一O112基金工程:教育部青年骨干教师资助工程(BL200013)作者简介:章骏(1978一),女,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生I袁维住(1957)男,上海师范大学生命与环境科学学院教授上海师范大学t自然科学版)1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物成年,健康罗氏沼虾(Maerobroxhiumrosenbergii),日本沼虾(Macrobrachiumnipporu,nse)及中华绒螯蟹(EriochirSinensisHMilneEdwar)购自上海农贸市场.兔抗Gqa多克隆抗体(c端序列:QINIKEY

5、NIV)为Sigma公司产品,二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及底物二氨基联苯胺(DAB)购自华美生物工程公司,蛋白质转膜用的硝酸纤维薄膜购自上海生物工程试剂公司,其余试剂均为进口分装或国产分析纯.1.2方法.2,l光适应与暗适应处理购置来的新鲜罗氏沼虾分为两组,一组于日光下光适应4h后解剖复跟,另一组置于全暗的环境中饲养1天,次日于微弱的红光下解剖复跟口.日本沼虾与中华绒螯蟹光适应4h后解剖复眼.1.0.2样品处理活体状态下切除实验动物的复眼,剥除外层角膜,剔除神经组织,将视紫红质局部放人冷冻的含蛋白酶抑制荆的缓冲液中(3mmo1/LMgC1,2mmol/I乙二醇双乙胺醚一N,N四乙酸.

6、10mmol/I三羟甲基氨基甲烷,10g-g/mI亮抑蛋白酶肽,76.8nmol/I,丝抑蛋白酶肽,07>mol/I胃抑蛋白酶肽,lmmol/L碘乙酰胺,0.23mmoi/L苯甲基磺酰氟,1外表活化剂,pH82)置于球箱,冷冻过夜.解冻之后,离心样品(100,000g/m,4c).30min后得到上清液.取罗氏沼虾眼柄中的蛋白,用同样方法处理.暗适应的罗氏沼虾于微弱的红光下处理,步骤同上.1.2.3蛋白质浓度的测定采用紫外吸收法测定蛋白质的浓度.1.2.4十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)取等量蛋白加样品缓冲液于i00C水浴5min,进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰

7、胺凝胶电泳(分离胶l0,浓缩胶5).1.2.5免疫印迹法鉴定Gq电泳结束后取一半胶用0.25考马斯亮蓝R一250染色,另一半胶用半干式电转移仪将蛋白质转移至硝酸纤维薄膜上(20mA,lh),丽春红染色,封闭液(含5牛血清蛋白的PBs)封闭2h.加一抗(1;5000)室温下温育2h,PBS漂洗3次,每次10rain.加二抗(1:50)室温温育lh,PBS漂洗3次.每次10rain.二氨基联苯胺(DAB)显色分析一.2结果2.1几种甲壳动物视网膜蛋白的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果日本沼虾和罗氏沼虾的视网膜蛋白条带数量根本相同,而中华绒螯蟹视网膜蛋白条带数量较少,这几种动物视网膜蛋白在97

8、kDa与66kDa之间及66kDa与43kDa处都有几条较粗的条带.在42kDa处,日本沼虾与罗氏沼虾都有一条蛋白条带清晰可见,而中华绒螯蟹在此处的蛋白条带不是很明显(见图(a)中A,B,E,F).免疫印迹法的结果显示:兔抗Gqa多克隆抗体在日本沼虾和罗氏第4期章驶,袁维佳.许燕几种甲壳纲动物感光器中cq蛋白亚基的研究97kDa66kDa43kDa30kna2lkD日【a)(b)(a):十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳,(b):免疫印迹(a)(A;中华皱螯蟹视网膜中的蛋白,B:日本沼虾视网膜中的蛋白,C:标准蛋白.D:罗氏虾眼柄中的蛋!.E:暗适应时罗氏沼虾视腭膜中的蛋白,F:光适应时罗氏沼

9、虾视网膜中的蛋白)(b)(A:光适应时罗氏沼虾视网膜中的蛋白.B:暗适应时罗氏沼虾视网膜巾的蛋白,C:口本怊虾视网膛巾ff勺蛋白,D:中华皱蟹蟹视网膜中的蛋白.E:罗氏沼虾眼柄中的蛋白)图1几种甲壳动物视网膜投眼柄中蛋白的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝腔电苏和免疫印迹浩图谱沼虾的视网膜蛋白中识别了一条蛋白条带,分子量大约在42kDa,在中华绒螫蟹的视网膜蛋白中没有识别到任何蛋白条带(见图(b)中A,B,c,D).2.2光适应与暗适应处理的罗氏沼虾视网膜蛋白的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法结果光适应与暗适应处理的罗氏沼虾视网膜蛋白的条带数量相同,在42kDa处两者都出现一条蛋白条带

10、(见图(a)中E,F).免疫印迹中,兔抗Gqa多克隆抗体在两者的视网膜蛋白中的同一位置上都识别了一条蛋白条带.识别的蛋白含量有所差异,暗适应处理的罗氏沼虾视网膜蛋白中检测到的蛋白较少,光适应处理的罗氏沼虾视网膜蛋白中检测到的蛋白较多(见图(b)中A,B).2.3罗氏沼虾视网膜中的蛋白和眼柄中的蛋白的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法结果罗氏沼虾眼柄的蛋白条带数量少于罗氏沼虾视网膜中的蛋白条带数,在42kDa处,罗氏沼虾跟柄中的蛋白不明显(见图(a)中D).兔抗Gqa多克隆抗体在视网膜的蛋白识别了一条分子量为42kDa的蛋白,而在眼柄中没有识别到任何蛋白条带(见图(b)中E).3讨论

11、用兔抗Gqa多克隆抗体在日本沼虾和罗氏沼虾的视网膜蛋白中都检测到免疫反响,在中华绒螫蟹的视网膜蛋白中没有检测到免疫反响,这说明在日本沼虾和罗氏沼虾的视网膜蛋白中有Gqa蛋白的存在,而中华绒螯蟹的视网膜蛋白中没有Gqa蛋白.在罗氏沼虾的眼柄中,Gqa抗体没有检测到免疫反响,即眼柄中没有Gqa蛋白的存在.Gqa抗体在日本沼虾和罗氏沼虾的视网膜蛋白中检测到的蛋白分子量约为42kDa.这与以往的研究结果是相同的.在乌贼:,章鱼1O,鲎:,果蝇等动物的感光器中,用免疫印迹法检测到的Gqa分子量都约为42kDa.最近发现在乌贼,章鱼和螯虾的感光器中,有两种形式的Gq:结合在膜上Gqa的和胞质中游上海师范大

12、学(自然科学版)离的Gqa.在螯虾的感光器细胞中,暗适应时,Gqn是结合在膜上的,光适应后,有一半的Gqa转移到胞质中成为游离状的Gqa0.在头足纲动物的感光器细胞中,暗适应时,胞质中游离状的Gqa很少,而光适应后,游离状的Gqa增加.且游离状的Gqa是没有活性的123这些研究说明,光照一段时间会导致Gqa的移位:从膜上移位至胞质中.对罗氏沼虾的复眼所进行的暗适应处理,是在微弱的红光下进行的,相对于光适应而言不是绝对的黑暗,因此在本结果中,暗适应处理的罗氏馏虾的视网膜蛋白中也检测到有少量的Gq蛋白n亚基.暗适应24h后,用抗体检测到的蛋白含量要明显少于光适应状态时检测到的蛋白含量.根据以往的研

13、究推测,所检测到的Gqa很可能是胞质中游离状的Gqa.暗适应时胞质中游离状的Gqa很少,光适应后,结合在膜上Gq蛋白a亚基转移到胞质中,胞质中游离状的Gqa增多.在信号传导过程中,G蛋白的a亚基对调节下游效应分子活性起着直接和特定的作用,n亚基可以与鸟嘌呤核苷酸结合,并且当与GTP结合时,G蛋白被激活,但与GDP结合时,G蛋白失活.无脊椎动物的光电传导中,在暗适应状态时,c,q蛋白的GDP结合在膜上,Gq蛋白处于失活状态.当光子激活一个视觉细胞时,跨膜受体也就是视紫红质发生变构,变构的视紫红质催化和其偶连的Gq蛋白的a亚基上的GDP转化为GTP,这个转变导致Gq蛋白a亚基的构象发生变化,形成有

14、活性的a-GTP,从而使得GTP与解离,分别与各自的效应分子作用.aGTP结合在膜上并激发了PLC酶链,PLC将PIP解离为DAG与IP:,从而导致通道的开启.细胞发生去极化.由于一个光子与受体的结合可以激活多个Gq蛋白,所以信号可以被放大,而信号的持续时间取决于n亚基与GTP结合形式的时间长短_l.光适应一段时间后,a亚根本身固有的GTP酶恬性缓慢地将GTP水解为GDP,终止了a亚基与其效应分子的作用,a-GDP从膜上别离出来,成为游离在胞质中的GqGDP,此时它丧失了活性.本实验根本确证了在甲壳动物的长尾类动物罗氏沼虾和日本沼虾的感光器中具有Gqa,在罗氏沼虾的感光器中,G的含量会随着光照

15、时间的不同而发生改变,这说明Gqa与罗氏褶虾的感光过程有关.在短尾类动物中华绒螯蟹的感光器中没有发现Gqa,Gqa是否在短尾类动物其他种类的感光器中存在,还有待进一步研究.参考文献1孙大业,郭艳林,马力耕.细胞信号转导M.北京;科学出版社,1997.4251.2TERAKITAA,HARIYAMAT,TSYJAGARAY,etat.InteractionofGTPbindingproteLnGqwithpho-toactivatedrhodopsininthephotoreeepterH1en1hranesofcrayfish厂J.FEBsletters,1993.330:197200.3TE

16、RAKITAA,HARIYAMAT,TAJAGAMAH,eta1.LightregulatedocolLzafionofthebeCesubunitofGq-typeGproteinntheerafishphotorecepters-J.JCompPhysiol(A),1998,183:4l1-417_4章骏,许燕,袁维佳.几种甲壳动精感光器中的Gq蛋白J.华东师范大学(自然科学版),2000,12:3236Es袁维佳,陈菅,潘晓震,等.钙商子j表庹对暗适应时的中华城螯蟹光感受嚣超擞结构的髟响J.动精学研究,l999,20(1):32-35.6DORLOCHTERM,KLEMEITM,STIE

17、VEH.1mmunologicademonstratL.nofGq-proteininLirautusDhe-toreceptorsEJ.VisualNeuroseenee,1996,14:287一Z92,7张龙翔,张庭芳,牵夸媛.生化实验方法和技术M.北京:高等教育出版社,1997103105.8萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯F分子克麈实验指南M北京科学出版社,I999.gNOBESC,BAVERSTOCKJ,SAIBILH.ActivationoftheGTPbindingproteinGqbyrhodopsinL口squidphotoreeeptorsJ.Btochem.J,199

18、2,287:545548.第4期章驶,袁维佳,许燕:几种甲壳纲动物感光器中Gq蛋白亚基的研究ElOTSUDAM,TSUDAT.TwodistinctlightregulatedG-proteininoetupusphotoeceptorsJ.NochimieaBiophysicaActa,1990,1052:204210.11BENTROPJ,PAULSER.LightmodulatedADPribosylation,proteinphosphorylationandproteinbindinginisolatedflyphotoreceptormembranesJ.EuropeanJournalofBiochemistry,1986,161:6167.12NARITAK,SUZUKIT.StructuralandfunctionaldifferencesoftwoformsofGTPbindingprotein.GhecephalopodretinarJ.ComparativebiochemistryandPhysiologyPartB.1999,123:319327GqccinRetinaofSomeCrustaceanZHANGJun,YUANWeij_a,XUYan(CollegeofLifeandEnvironmentSciences,ShanghaiTeac