荧光免疫分析

1、荧光免疫分析法报告大纲一、引言二、基本模式三、标记物四、信号放大技术五、分析检测技术六、与高效分离技术的结合七、发展趋势八、时间分辨荧光免疫分析技术放射性免疫分析法 免疫分析是基于蛋白抗原和抗体之间、或者小分子半抗原和抗体之间的特异反应的分析方法，是生物分析化学的重要内容之一。 非放射性免疫分析酶免疫分析法EIA是一种有效的非放射性免疫分析方法，它以酶为标记物，结合酶的高效放大作用和显色检测的简便性，从而得到了广泛应用。但亦存在着酶稳定性差，对抑制和变性因素敏感等问题。 化学发光是在特定化学反应中产生的光辐射，化学发光免疫分析法CLIA是化学发光与免疫测定结合起来的一种高效检测手段，灵敏度高，

2、不需激发光源，仪器简单，但是可以利用的化学发光反应相对有限。光荧光免疫分析法FIA与EIA、CLIA法相比，具有灵敏度高、可测参数多、动态范围宽、标记物稳定且可实现均相免疫分析等优点，特别是TRFIA的发展，极大提高了FIA的检测灵敏度。目前已成为一种成熟有效的非放射性免疫分析法得到广泛应用，是免疫分析研究中最为活跃的领域。竞争型夹心型基本模式 标 记 物有机荧光染料蛋白质荧光标记物酶标记物金属配合物标记物纳米荧光标记物常用为荧光素类及罗丹明类染料荧光素类标记物的荧光量子产率高，有较好的光稳定性和低的温度系数，但其荧光对散射光敏感。罗丹明类标记物荧光产率较小，但其发射波长较长，样品背景干扰较小

3、。藻胆蛋白是一类具有优良性质的荧光标记物，绿色荧光蛋白是紫外-可见区另一种具有潜力的标记物。由于酶分子的催化放大作用，酶标记物在FIA中占据重要地位。目前研究较多的无机荧光配合物以铕和铽居多，另一类是在近红外区发射荧光的贵金属离子配合物。应用较多的是发光半导体量子点和荧光复合型纳米颗粒。荧光纳米颗粒的出现对生物大分子的检测方法产生了重要的影响，不仅提升了现有分析方法的灵敏度，还提供了无可比拟的标记灵活性，结合信号放大技术，可进一步提高分析灵敏度，其在荧光免疫分析中无疑具有旺盛的生命力。信号放大技术酶联放大技术脂质体包裹技术多重标记技术聚合酶链式反应放大技术脂质体包埋荧光免疫分析示意图分析检测技

4、术时间分辨荧光免疫分析相分辨荧光免疫分析同步-导数荧光免疫分析荧光偏振免疫分析与高效分离技术结合色谱免疫技术免疫亲和色谱免疫亲和萃取技术流动注射免疫分析高效毛细管电泳荧光免疫分析磁性分离“智能高分子”相变分离智能高分子对环境因素敏感的特性使得可以利用其 将免疫反应复合物与未反应的标记抗原或抗体分离，从而建立相分离荧光免疫分析法。该方法兼具均相免疫反应的快速性和异相免疫分析法的高灵敏度。 相变分离荧光免疫分析法的发展趋势（1）高特异性、高亲和性抗原和抗体的制备。（2）荧光标记物进一步更新和相应的荧光检测技术的提高。（3）与高效分离技术相结合。（4）实际应用中的在线和现场荧光免疫分析。（5）免疫芯

5、片的实用化以实现微量多组分的免疫分析。时间分辨荧光免疫分析 TRFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针和生物细胞，待反应体系（如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用TRFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。时间分辨荧光测定原理示意图 镧系元素属于稀土元素，常用于TRFIA的主要有铕（Eu）、钐（Sm）、铽（Tb）、镝（Dy），具有独特的荧光发光特点： 镧系离子螯合物荧光衰变时间长； 激发光与发

6、射光之间的Stokes位移较大； 被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐。种类荧光寿命（ns）非特异背景荧光110人血清血蛋白4.1人球蛋白、血红蛋白3.0细胞色素C3.5异硫氰酸荧光素FITC4.5丹磺酰氯14苯胺萘磺酸16稀土螯合物104106稀土离子螯合物激发光波长 发射光波长 Stokes位移Eu-(-NTA)3340613273Sm-(-NTA)3340600260Tb-(PTA)3295490/543195/248Dy-(PTA)3295573278 实现分析的技术类型 夹心法 竞争法 间接法 捕获法 应用亲和素和生物素的TRFIA稀土离子的标记常用稀土离子螯合剂多氨基多羧酸类螯合物芳香羧酸类螯合物-二酮体类螯合物特殊功能的螯合物稳定性较强，溶解度较高，螯合能力强，标记物的比活性较高，但是传递激发光的能力弱。，检测时可以直接测量结合物的荧光强度，无需加入增强液，主要用于固相时间分辨系统。增强液中的主要成分，但螯合物不够稳定，只能用于检测不能用于标记。主要有W1174和W2014两种，是异硫氰酸盐类似物。主要分析系统非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相荧光免疫分析解离增强镧系荧光免疫分析酶放大镧系发光