紫外分光光度法测定核苷酸含量

1、生物化学实验：生物化学实验：核酸的紫外扫描及含量测定核酸的紫外扫描及含量测定实验目的实验目的v1.1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。握其使用方法。 v2.2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。量的原理和方法。实验原理实验原理v核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。紫外吸收。RNARNA和和DNADNA的紫外吸收峰为的紫外吸收峰为260nm260nm。一般。一般在在260 nm260 nm波长下，每毫升含波长下，每毫升含1mg DNA1mg DNA

2、溶液的光吸收溶液的光吸收值约为值约为0.0200.020，每毫升含，每毫升含1mgRNA1mgRNA溶液的光吸收值为溶液的光吸收值为0.0220.022。故测定待测浓度。故测定待测浓度RNARNA或或DNADNA溶液溶液260nm260nm的光吸的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。纯净的先除去。纯净的RNARNA溶液，其溶液，其A260/A2802A260

3、/A2802；纯净；纯净的的DNADNA溶液，其溶液，其A260/A2801.8A260/A2801.8。 实验原理实验原理v如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(2050mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。，在紫外分光光度计上直接测定。 v 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在蛋白质的吸收高峰在280nm处，在处，在260nm处的吸收值仅为处的吸收值仅为核酸的

4、十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。核酸的紫外测定影响不大。 v RNA在在260nm与与280nm处的吸收比值在处的吸收比值在2.0以上，以上，DNA的的比值则在比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。降。 实验器材实验器材v1.UV-1000型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计 v操作指南：操作指南：v1. 打开仪器电源，系统自检，并预热打开仪器电源，系统自检，并预热20min。v2. 选择选择“光度测量光度测量”，按，按“enter”进入吸光

5、度测量。进入吸光度测量。v3. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按按“enter”进入后，系统自动调整投射比为进入后，系统自动调整投射比为100%和和0%。v4. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按按“zero”键调使吸光度键调使吸光度A为为0.000。v5. 测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定测量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定后，读取吸光度。后，读取吸光度。v6. 仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。仪器使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。v7. 关闭电源开关，拔下

6、电源插头，复原仪器。关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。v8. 登记登记仪器使用记录表仪器使用记录表v关于比色皿：比色皿的前后有关于比色皿：比色皿的前后有2个光滑面，是用来对准光路的，个光滑面，是用来对准光路的，左右有左右有2个粗糙面，手只能拿比个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿的内部的清洗只能面。比色皿的内部的清洗只能用蒸馏水润洗（用洗瓶），不用蒸馏水润洗（用洗瓶），不可用卫生纸或其他物品捅进去可用卫生纸或其他物品捅进去擦洗，比色皿的擦洗，比色皿的2个光滑面一定个光滑面一定要保持清洁，如发现有指纹或要保持清洁，如发现有指纹或残液，须用卫生纸轻

7、轻擦拭干残液，须用卫生纸轻轻擦拭干净。比色皿是成套发放的，严净。比色皿是成套发放的，严禁混用，本实验使用的是石英禁混用，本实验使用的是石英比色皿。使用完毕后先用自来比色皿。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外表面洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次，次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。中。2.取样器：参见实验一，取样器：参见实验一，10uL、200uL各各1支支/组。组。v使用指南：接好套头（不漏气）使用指南：接好套头（不漏气）通过旋钮调节容量（如通过旋钮调节容量（如500表示表示5mL）用活塞第一挡吸液用活塞第一挡吸液用活

8、塞第一挡和第二挡放液用活塞第一挡和第二挡放液换套头换套头继续使用。继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。而损坏仪器。 v3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。 v实验试剂实验试剂v1. 蒸馏水蒸馏水 v2. 待测的待测的DNA溶液溶液 样品测定：样品测定：v1. 取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个用来加用来加DNA样品。样品。v2. 取取10uL的的DNA样品样品, 加入加入90uL的蒸馏水稀释的

9、蒸馏水稀释10倍。进行测定含量。倍。进行测定含量。v4 清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂。数据处理第一组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0270.0530.1210.1700.2550.324（nm）240250260270280290A0.1780.2250.3230.2640.1850.081m260试管1234567A26000.0270.0530.1210.1700

10、.2550.324试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.9ml待测的DNA溶液的浓度（g/ml）38g/ml由公式V*100/5计算待测DNA溶液的A260/A2801.8待测的DNA溶液是否纯净不纯净第二组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0400.0690.1320.2100.2640.309（nm）240250260270280290A0.1770.2650.3090.2560.1710.080m260试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.91ML待测的DNA溶液的浓度（g/ml）

11、38.1A260/A2801.76待测的DNA溶液是否纯净不纯净第三组：试管1234567标准DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0360.0640.1200.1730.2620.298（nm）240250260270280290A0.1740.2680.2980.2590.1670.079m260试管8对应于标准DNA溶液的毫升数V1.97ML待测的DNA溶液的浓度（g/ml）39.4A260/A2801.77待测的DNA溶液是否纯净不纯净思考题v1.若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰？v答：当样品中蛋白质含量较高时，将样品移到试管中，加入一定量的吸烟溶液，用玻璃棒小心搅拌，使蛋白沉淀，滴加少量25%sos溶液边加边轻轻搅拌，加完后，在60C水溶中保温10mi