定量PCR技术详解(终点定量、实时定量)

1、PCR 技术业精于勤而荒于嬉行成于思而毁于随定量PCF技术传统终点定量法： 为终点定量，重现性差、误差较大，只能作半定量、粗略定量缺点：1、传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而 PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量推算岀起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。2、在待测样品中加入内标，贝U PCR反应变为双重PCR双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的 起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著，由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量 的已知模板作为内标。方法：以看家基因

2、为内参，通过目的基因与看家基因扩增产物的电泳条带的灰度、宽窄、光密度比值 来确定待测目的基因的表达量。内参基因（看家基因）：在细胞中的表达量或在基因组中拷贝数恒定，受环境因素影响较小，用于对样本初始浓度差异进行均一化 校正，常用的有B -actin 、GAPDH 18sRNA等。1） 内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标 记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开 来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产

3、生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化 PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切， 可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR-ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体- 辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。荧光实时定量法：为扩增期定量，重现性好、误差

4、较小SYBR Green I 染料法TaqMan Probe 探针法1、绝对定量：标准曲线扩增曲线：荧光强度 -循环数曲线 -Ct值标准曲线：初始模板量对数 -Ct值（呈线性相关）数学基础：理想状态 Xn = X 0 X 2 n代表扩增效率X ct为达Ct值时扩增量非理性状态：Xn = X 0 （1 + Ex ） nExlogXn = log(X0 (1 + Ex ) n)logX。=(-log (1 + Ex ) n + logX nlogX。=(-log (1 + Ex ) n + logX C方法：将已知浓度的相应 DNA模板（标准品）梯度稀释，根据实时PCF得到相应的Ct值，构建标准曲

5、线；同时，待测样品也进行PCR得到未知浓度的待测样品的Ct值，再根据标准曲线得岀其初始浓度。标准品：a.含有和待测样品相同的扩增片段的克隆质粒b. 含有和待测样品相同的扩增片段的cDNAc. 纯化的待测样品PCR扩增产物紫外分光光度计或荧光酶标测定标准样品浓度，根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，作系列梯度稀释待测样品浓度=OD260 X 40 X稀释倍数 （ng/卩l ）待测样品分子量=碱基数X 324待测样品拷贝数=待测样品浓度/待测样品分子量 X 6 X 10 142、相对定量：引入管家基因，比较 Ct值得到相对量（差值或倍数），可用于基因表达差异性分析 两种样品：待测样品、对照样品（

6、如正常组织）两个基因：目的基因、管家基因（如B-actin、GAPDH 18sRNA（1）双标准曲线法 方法：a.用目标基因和内标基因的标准品分别制作标准曲线b. 待测样品和对照样品同时扩增目的基因、内标基因，获得Ct值c. 通过标准曲线计算目的基因、内标基因的绝对初始拷贝数d. 用内标基因对目标基因均一化e. 均一化后的目标基因值之比得岀待测样品和对照样品中目的基因的表达差异公式：校正值=目的基因定量值/管家基因定量值相对值=待测样品校正值/对照样品校正值优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因、每一轮试验都必需作标准曲线(2) 2- Ct 法数学基础：PCF反应方程Xn = X 0 (1 + Ex )Xt = Xo(1 + Ex ) Ct均一化：XtM XmoO + Em )CtMXno(1 - En)CtNXtN（M目标基因、N内标基因）X M0X N0(1 En )CtN(1Em )CtM优化实验条件En = E M = 1X M0_2(CtM-CtN )_ 2_.CtX N0K2Ct2样品 2 与样品 1 相比