蛋白纯化和GST沉降技术

1、蛋白纯化和GST沉降技术【原理】细菌表达的谷胱甘肽s一转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化， 也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据 谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一 股在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体十扰蛋白质一蛋白质之间的相互作用 时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。【应用】1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白问的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质问可疑的相互作用【方法】一、GST融合蛋白的纯化1、 菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般 50ul的冻存菌

2、接入5ml 的 LB 中，37 C 220rpm 培养2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37C 220rpm 培养至。0.40.6 之 问，即到达对数生长时期（大约 34小时）3、 取1ml菌液测定OD值，至。 0.40.6之间，则取诱导前1ml,其余的按1/1000加入诱导剂IPTG，低温小量诱导30C 200rpm，诱导过夜（小于16hr）4、 次日取诱导后1ml,诱导前和诱导后各1ml, 12000rpm，离心2mins,弃上札加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1* loading buffer ,混匀，沸水煮10mins, 12000rpm ，离心2mins, SDS-PAGE

3、电泳考马氏亮兰染色5、如果考染结果显示GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导6、菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30 C 200rpm 扩大培养至 O*0.40.6之间，即到达对数生长时期（大约 3小时）7、取1ml菌液测定OCfi,至Ot0.40.6 之间，按1/10000加入诱导剂IPTG ,低温诱导20C 180rpm，制冷系数0.5,诱导过夜8、次日50ml离心管收菌，4C 5000rpm 5mins 离心，每瓶100ml重复离心收 于同一离心管中，大型离心机提前预冷9、每100ml菌液沉淀加入10ml A液重悬10、超声破碎。大探头，冰浴，频率 510o超声2

4、3s停23s, 1520次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液活亮为止11、 超声后的细菌裂解液加入到 50ml十净离心管中，4C 11000rpm 10mins离心12、 平衡 Agrose-beads.每个十净 EP管中加 50ul Agrose-beads。再加 1ml A 液，4C 旋转 23mins 后 4 C 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃 上活，重复3次13、吸取菌液离心上活到50ml十净离心管，将平衡好的 Agrose -beads加 入4C 旋转4小时左右14、 4C 3000rpm/600 g 10mins离心。移液管吸弃上活，留有 1ml左右 时用移液器

5、枪头混匀X-GST-beads,转移至1.5 ml进口 EP管中，用A液 反复洗50ml离心管多次至将全部珠子转移至 EP管中。3000rpm/600 g , 5mins,离心，弃上活15、A 液洗涤 X-GST-beads,每次 1ml 4 C 旋转 10mins 后 4C3000rpm/600 g , 5mins,离心，吸弃上活，重复 3次16、最后向X-GST-bead中加入100 ul A 液，4C 保存17、考染定量：取 2ul GST-beads 加入 10 ul 1* loading buffer 混匀，沸水煮样10mins。12000rpm 5mins离心后取上活上样（SDS-

6、PAGE下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液23 mins,旧的考染液1030mins ）, 脱色2 h左右二、GST Pull down1、转染细胞24小时后，IP buffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频率510。 超声23s停23s, 1520次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液活亮为止， 12000rpm,离心2mins,取上活作样品，取部分作 In put,剩下的作GST Pull down2、根据定量结果取 X-GST-beads加入到IP buffer 平衡，4C 旋转23mins后4C 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃上札 重复3次。然后将平衡后 的珠子于60

7、0ul cell lysis结合孵育4h±夜3、4C , 3000rpm/600 g , 5mins 离心后吸回裂解上活，IP buffer洗珠子， 4C 旋转 10mins 后，4C 3000rpm/600 g 5mins 离心,23次。最后用微量上样器将全部IP buffer 吸弃。4、向 X-GST-beads其中加入 30 ul 1* loading buffer.细胞裂解液 In put 50 ul 中加入 50 ul 2* loading buffer .沸水10mins。12000rpm 5mins离心后取上活上样进行 SDS-PAGE5、电泳后进行Western Bl

8、ot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以将胶考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白。【注意事项】1）该实验设立GST对照，反应均在4cC进行2）沸水煮样以前的离心速度不要超过 3000rpm,否则可能将beads离碎了。3）在检测时如果发现GST对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我们应当在GST Pull down的第三步多洗几次。4）GST对照蛋白的量和实验组的蛋白的应该一样，最好是对照的量比实验 组的多一点【举例】input GST Y-GST+GST pull down验证两种已知蛋白质的相互作用input GST X-GSTY-GFP +X

9、-GFP Y-GFPAnti-GFP, X-GFPAnti-GFP2免疫共沉淀Cell Lysate or Protein MixlureIncubation withAntibody Coupled Resin. 4 AnalyzeCoupled Antibody AntigenProtein Interacting with Antigen图2免疫共沉淀（co-IP）示意图（1）原理1）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质 是否在体

10、内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档（图2）02）缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用（2）方法1）转染后24-48 h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制 剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4° C,取少量裂解液以备 Western blot分析 做Input,剩余的裂解液以最大转速离心10 min后取上活，2）取10 l protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般 1ML/管）平衡 3次，每次3,000 rpm离心5 min,3） 将预处理过的10 l protein A琼脂糖珠加入到细胞裂解液中 4° C缓慢 摇

11、晃孵育1h,进行预沉淀。4）3000rpm离心后收集上活，将沉淀弃去，上活备用，5） 加1 g相应的抗体加入到4）的上活液中，4° C缓慢摇晃孵育1h他可 过夜），6）取10 l protein A/G琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般 1ML/管）平 衡3次，每次3,000 rpm离心5 min,7）将预处理过的10 l protein A/G琼脂糖珠加入到和抗体孵育过的细胞裂解液中，4° C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A/G琼脂糖珠偶连，8） 免疫沉淀反应后，在4° C以3,000 rpm速度离心5 min,将琼脂糖珠 离心至管底。将上活小心吸

12、去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次。最后加入15 l-30 l的1 X SDS上样缓冲液，沸水煮10分钟,9）SDS-PAGE, Western blotting 质谱仪分析。（3）注意的问题1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质一蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件 是不一样的，通过经验确定。一般如果相互作用很弱时可以考虑将盐浓度尽量降 低，同时可以考虑加入皎链剂。不能用高浓度的变性剂（0.2% SDS）,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂， 如商品化的cocktail。2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用，抗体的用量参考抗体使用 说明书。3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG