蛋白表达纯化试验步骤

1、蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA o2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、 RT-PCR, KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。5、转化到DH5也感受态细菌中扩增，提质粒。6、 将质粒转化入表达菌株， 挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21 （ DE3）、Rosetta gami（ DE3 ）、 Bl21 codon （ DE3）等。7、蛋白的诱导表达。1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至 OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25 M 到

2、1m M。37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。3） 将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22 m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。4） 用上述IPTG浓度范围的最低值诱导 10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm ）, 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入 1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着

3、细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成 50 l 一管，每次用一管，避免反复冻融。8、包涵体检测。方案见 附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。1）取保种的表达菌株先摇 10ml, 37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌。2） 将上一步中的 8ml加入300ml培养基中 37度，250rpm摇至 OD= 1.0左右（约 2.5h3h），然后加IPTG （浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可

4、。另一方法是，将手指放在瓶底 晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。4）将菌液6000rpm , 4min , 4度离心收集菌体。加入 20mM PBS ,洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。10、超声波裂解。1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量

5、气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。4. 正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变 清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后 面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作 30分min要休 息5min （即关闭总电源开关）。注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）, PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。11、取得上清1）将破碎好的溶液收集到 50ml离心管中。10000rpm , 15min ,

6、4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后 上清就会在7.5左右。）12、纯化上清-摸洗脱条件。1） 镣柱处理。将1ml镣柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2） 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20 l过柱后的样品，以备跑胶。3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪哩梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4m

7、l、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗 脱了。4） 加Elution Buffer将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml （将前面的0.5ml单独接入EP 管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。5）加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H 2O。流完后保存于 2倍体积的20%乙醇中，镣柱至少能重复利用6次。（尿素可能对 NI柱有损伤。）注意：所

8、有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镣柱所用溶液 MES 的 ph=5.0 ,其余 Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清 pH=7.5 , Wash Buffer pH=7.0 , Elution Buffer pH=7.2 。13、跑胶验证。1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相 同两块胶才会比较一致。2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、 W7、W8、W9、E1、E2、MES3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以3

9、00V,30min,只是 图没有160V好看。）4）考马斯亮蓝染色。一般染色 2h即可。5）脱色。先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。14、纯化上清-收集目的蛋白1）将重生的镣柱再次平衡（即加 Equilibration Buffer 3ml ）。2）重复步骤12中的操作，只是 wash时只用步骤12中摸好的咪哩浓度洗。15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V）,保存好。16、透析。1）配制2L透析液（配方见附件 1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H 2。充分洗净。3） 用透析夹将透析

10、袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其 中，置入提前预冷的 500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl ）中。冰浴下轻微磁力 搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的 2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。17、浓缩。1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。4）透析袋用完后，洗净，保存于 20%乙醇中4°存放。注意：浓

11、缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状， 透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估 计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶 液分装后-20度保存。18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。1）将4ml Elution得到的蛋白溶液加入超滤管中。2）配平。3）7400g, 30min, 4°离心，结束时 4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可

12、以使 Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和 pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。5） 收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白 浓度（测量后），制备日期。注：超滤管的使用方法见附件 419、蛋白浓度测定。见附件 320、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。22、注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗体。24、抗体效价评定。附件1所需溶液配方：1) 20 mM

13、PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g） 1L0. 59285.80219217.5322) Equilibration Buffer (平衡缓冲液)：PBS with 10 mM 咪哩 pH 7.43) Wash Buffer (清洗缓冲液)：PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪哩 pH 7.44) Elution Buffer (洗脱缓冲液)：PBS with 250 mM 咪哩 pH 7.45) MES (再生缓冲液)：20 mM 2-(N

14、-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。即 0.3904g MES+0.5844g NaCl.6) 透析袋处理液：2% (w/v)碳酸氢钠和1 mmol/L (pH8.0) EDTA7) 透析液：20mM PBS+50 mM NaCl (2.92g)试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量(g) 1L0. 59285.8021922.92gTIPS:1 4的溶液可以一起配制。先配 10ml 8M的咪哇。再配1L的PBS,用500ml水将 试剂溶解，取两个 50ml和一个150ml

15、分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer 和 Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的 8M 咪口坐。 最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer 各配了 100ml, Equilibration Buffer 配了 300ml。PBS 配了 500ml。附件2包涵体检测1.摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）。在 离心前取500 l菌液作为负

16、对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸 10min跑胶。2.诱导完成后，用 2ml EP管6000rpm, 2min, 4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS (50m MPBS,300m M NaCl ）重悬细菌。3. 裂解细胞。用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般 15到30min。裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置。4. 分离上清。5000rpm , 4min , 4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后， 10000rpm, 10min , 4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5 微 5*SDS l

17、oading buffer 混匀，煮沸 10min。5. 重悬包涵体。用1000微PBS震荡重悬包涵体，取 20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer，煮沸 10min。6. 正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40 l,加入10l5*SDSloading buffer,煮沸 10min 裂解。7. 跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是：-,+,上清,包涵体.附件3蛋白浓度定量测试方案1. 将染色剂稀释。稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H 2O.充分溶解后用 0.44 m 的滤膜过滤于另

18、50ml离心管中。（此剂量可测4个样品。）2. 牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备1） 将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500 l/支（可以 室温放置60天，-20度长期保存）。2） 将1mg/ml的BSA分别稀释成 0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml ,各180 l,另外加一管水为零对照。浓度0.2mg/ml0.4 mg/ml0.6 mg/ml0.8 mg/mlBSA (1mg)36 l72卬l108 卬 l144 lH2O144 私 l108 卬 l72私l36 l3.染色。1） 取1.5ml已过滤的染色剂分别加入 13支（其中4支为待测样品）1

19、.5mlEP管中。4个 梯度各做一个重复，共 8支，另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank,共10支 EP管（或10+n支），分别对应标记。2）将30 l样品和30 l标准BSA及30 l H2O分别加入上述 EP管中。涡旋混匀。3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在 60min内测完，越快越好，因为Absorbance wil increase over time 。4. 吸光度的测量。600nm处测量，并记录吸光度。注意：1. blank是染色液加30微升的水。2. 从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测

20、量顺序。5. 比色皿的洗涤。用100%乙醇浸泡洗涤。6. 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。附件4.4ml millipore超滤离心管使用注意事项1. 用前用miliq水润湿。2. 4度预冷。3. 离心力不能超过 7500g。加速度设定为 8.4. 离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一致。5. 使用完毕后，用 miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h,后加入1ml20%乙醇保存。 如果要短期保存几天，也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法 附件6.包涵体蛋白的提纯与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer中各加了 6M尿素或盐酸月瓜。尿素或盐酸月瓜用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先 3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再 10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。 用加了 6M尿素或盐酸瓜的 Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致， 只是所用 Equilibration Buffer 、Wash Bu