基因工程重点考点归纳

1、第一章1. 简述基因工程中的四大要素。答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。2. 简述基因工程诞生的基础。答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子， 标志着 DNA重组时代的开始。1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来，得到新的DNA分子。1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切 DNA分子与质DNA连接起来，并将重组 质粒转入E.coli细胞中。理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物

2、质（2）DNA 双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith和Wilcox（1970）流感嗜血杆菌分离纯 化了 Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2） 基因运载工具一DNA载体的使用（对质粒的认识）【细菌的致 育因子一F因子Lederberg 1946抗药性因子（R） 大肠杆菌素因（Col ）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore和Temin （1970）各自发现了 逆转录酶】意义：丰富了 "中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA文库成

3、为可能。第二章1简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制一修饰系统（R-MRestriction-modification system） 。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。根据酶的亚单位组 成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。2.11型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3 -羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需 SAM。其识别序列主要为 4-6bp，或更

4、长且 呈二重对称的特殊序列。3举例：你使用过的工具酶，用于做什么？应该注意的问题T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶的分子量为 68 kDa，催化DNA5 '磷酸基与3'羟基 之间形成磷酸二酯键。应注意的问题是连接反应条件需要ATP,若在16 C反应，大约需4小时；若在4C反应，则需反应过夜。第三章1. 简述蓝白斑筛选的原理。如果插入的目标基因较小，仅使用蓝白斑筛选合适吗？对于白色菌落还需要做哪些进一步的鉴定？答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体a -互补的遗传特征筛选重组子。宿主大肠杆菌的DNA的短区段，lacZ M15基因：缺失3 -半乳糖苷酶中第 11-41

5、个氨基酸 的lacZ基因，无酶学活性。而载体一般带有lacZ ' : N-端140个氨基酸的lacZ基因，其产物无酶学活性。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS ）,它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到3 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码3 -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性， 但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为a -互补。由a-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物 X-Gal

6、存在时产生蓝色菌落，因而 易于识别。然而，当外源 DNA插入到质粒的多克隆位点后，由于插入片段较大，几乎不可 避免地导致无a -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重 组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。对于较小的基因片段，由于其可能无法完全阻止a -互补，通常会出现假阴性。如要进一步确认，可对白斑提取质粒，再对质粒进行双酶切，电泳以确定，所取白斑的菌中含有目的基因。2作为克隆载体应具备哪些条件？比较 pBR322, pUC19和pUC119相同和不同点？ 答：克隆载体应具备的条件：（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗生基因（3）具若干限制酶 单一识别位点（4 ）具有较小的

7、分子量和较高的拷贝数。pBR322 与 pUC19 相比：共同点：pUC19和pUC119从pBR322改造得来的，它们含有相同的ori和氨苄青霉素抗性基因；pUC119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来。不同点：（1） pUC19抗性基因的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核 酸内切限制酶的单识别位点，（2） pUC19含有大肠杆菌3 -半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码a-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ '基因（3） pUC19含有位于lacZ '基因 中的靠近5'-端的一段多克隆位点（MCS ）区段，但它并不破坏该基因的功能。（

8、4） pUC19的分子量比 pBR322小的多，只有2686bp （5） pBR322还含有四环素抗性基因。pUC19与pUC119相比，pUC119多了 M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进 入噬菌体颗粒所必须的顺式序列（IG ）。3为什么在辅助噬菌体 M13K07帮助下可以有效地制备 ssDNA?答：M13K07的突变基因H产物优先与克隆于噬菌粒pUCII8和pUCII9中的病毒复制起点的作用，这就使噬菌粒正链 DNA能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌 粒的单链DNA能够占据优势。第四章&第五章1对比下列各组概念：（1 ）克隆载体、表达载体和穿梭载体（2）

9、plasmid, phagemid and cosmid（3）PAC, BAC and YAC答：（1）克隆载体：以扩增或保存 DNA片段为目的的载体，一般具有复制起点，抗菌素抗生 基因，若干限制酶单一识别位点和较小的分子量和较高的拷贝数。表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来，主要增添了增强子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件， 进行DNA重组的目的是要获得表达产物。相对于克隆载体来说增加了表达元件，基本骨架 是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，表达形式主要是融合蛋白的形式，表达载体除了提供复制属性外，主要是形成一种表达所必须的环境。穿梭载体能够在两类不同宿主中

10、复制、增殖和选择的载体，主要为质粒载体，相对与克隆载体和表达载体而 言，穿梭载体至少含有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。穿梭载体一般在大肠杆菌中保藏、扩增，然后将其转到目标宿主中。（2） plasmid:质粒，指的是染色体外能进行自我复制的双链闭合环状DNA分子，通常一个 质粒含有一个Ori以及与此相关的顺式作用元件，复制方式分为严谨型和松弛型且具有不相容性和转移性。phagemid是噬菌粒，指的是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质 粒和丝状噬菌体的特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状体噬菌体的间隔区，由于基因H蛋白存在有利于产生ssD

11、NA，带有这种质粒的细菌被M13丝状噬菌体感染后，在基因n蛋白影响下质粒复制方式发生改变。Cosmid是黏粒，指的是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，组成包括质粒的复制起点、抗性基因、cos位点，可以像质粒一样转化和增殖。（3） YAC （酵母人工染色体载体）：结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNA分子，其 工作状态是线状的，YAC载体以环状的形式存在，增加了大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。其中复制元件是其核心组成成分，有ARS、TEL、CEN，选择标记主要是采用营养缺陷型基因。BAC （细菌人工染色体载体）：其与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性，BAC

12、复制单元来自F质粒，其载体的低拷贝数可以避免嵌合体的产生，减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用，其标记基因是氯霉素抗性基因。PAC （ P1人工染色体载体）：PAC载体结合了 P1载体和BAC载体的最佳特性，相当于 P1噬菌体的改进载体。2. 简述用YAC为载体时，重组菌的筛选方法。答：YAC载体的选择标记主要是采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺 陷基因trp1、Ieu2和his3,尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3,以及赭石突变抑制基因sup4。其宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。赭石突变酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup

13、4的载体存在于细胞中时，可抑制 ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。第一步筛选：营养互补筛选，第二步筛选：看颜色改变是 否表现出插入抑制基因致其失活。3. 简述pET表达系统，如何控制外源基因的表达？答：有两套系统可控制外源基因的严谨表达，一套是通过宿主控制 T7 RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE ,它们分别低量和高量表达 T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。另一套是使启动子的控制效应更严谨，在pET载体上装载acl基因，提高阻抑物的浓度。同时

14、也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在 T7RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。4. 为什么采用增加融合标签的技术，表达外源基因？答：因为当蛋白表达以后， 有效的分离纯化或分泌就成为获得目的蛋白的关键因素。通过融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质，可对目的蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽 S转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质 A和纤维素结合域等，其主要是因为

15、这样可以分离纯化目的蛋白。第五次1比较各组概念：（1）琼脂糖电泳、PAGE、PFGE（2）southern blotting、 northern blotting、 western blotting（3）RT-PCR DD-RT-PCR Real time PCR答：（1）琼脂糖电泳：用于 DNA的分离、检测和纯化。检测DNA是否真的存在、是否有降解现象，以及 DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何。对0.8- 10kb的DNA分离效果最佳。PAGE:即聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测小分子核酸的大小（如小相对分子量RNA、寡核苷酸、DNA序列分析等），或在同位素标记的情况下分析单链核酸（如分离寡

16、核苷酸探针和DNA测序等）。对100 bp-1kb的核酸分离效果最佳。PFGE:即脉冲场凝胶电泳。分离大相对分子质量的DNA的片段。原理是用一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“ Z”字形向前泳动，从而达到分离大相对分子质量的DNA片段的目的。针对 50kb或100kb以上，甚至 Mb级的大片段 DNA。（2）southern blotting:即将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜上，然后进行分子杂交，在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。该技术主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制酶切片段的大小。前提是必

17、须有探针。northern blotting:与Southern杂交相似，只是在Blotting过程中转移的是 RNA。主要用 来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。western blotting :将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法， 称为Western印迹转移。该技术与 Southern杂交相似，只是在 Blotting过程中转移的是蛋白 质。其主要应用于检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。（

18、3） RT-PCR：即反转录PCR。以反转录的cDNA做模板所进行的 PCR反应，用于测定基 因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变，呈mRNA多态性，克隆 mRNA的5'和3'末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的 cDNA文库。DD-RT-PCR :即差异显示PCR。用于检测相似生物材料的基因表达谱差异的一种方法， 是PCR和反转录有机结合并深化应用的产物。Real time PCR :即实时定量 PCR。通过特定设计的 PCR仪器来实时检测 PCR扩增过 程每一轮循环产物的累积数量，可以很好地推算模板的起始浓度。答：首先要保证 DNA和RNA不变性。

19、然后注意提取溶液的浓度，pH等。此外，就是要提取周期短，周期越长提取效果越差。步骤尽量简洁，过于繁琐的步骤会让生物大分子活性降 低。对于RNA，由于RNA酶相对来说非常耐高温，因此应注重RNA酶在各种器物上的残留问题；为了防止 RNA降解，一般要在样品中加入RNA酶抑制剂。提纯过程中的副产物也是需要考虑的因素，要保证他们不能影响提纯工作的进行。3. 简述PCR原理和应该注意问题。答:DNA聚合酶在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。经过20-40个循环(变性、退火、延伸 3个热反应过程可称为一个循环)可扩增得到大量位 于两条引物之间序列的 DNA片段。注意问题：

20、长度：至少 16 bp,通常为18-30 bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性， 但会提高扩增的有效性。 解链温度(Tm值)：两个引物之间的 Tm值差异最好在2-5 C。对于小于20 个碱基的引物其 Tm值可用简易公式计算即 Tm=4 (G+C) +2 (A+T )。 避免引物内部或引物之间存在互补序列(3个碱基)，减少引物二聚体以及引物内部二级结构的形成。 G + C含量尽量控制在 40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3'末端的重复排列。 引物的3'末端最好是 G或C,但不要GC连排。4. 简述Sanger双脱氧链终止法测序

21、的原理。答：双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3'位置的-OH缺失，当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能够像正常核苷酸一样参与DNA合成，以其5'位置的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的3'位置的-OH结合，但是，由于它自身3'位置-OH缺失，致使下位核苷酸的5磷酸基团无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的 DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。基于双脱氧核苷酸的这种 特性，建立了以双脱氧链终止反应为基础的DNA序列测定的方法。第十一章1如何保证cDNA文库的质量？(1) RNA的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸

22、胍一有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的 选择主要根据不同的样品而定)。(2) 要构建一个高质量的 cDNA文库，获得高质量的 mRNA是至关重要的，所以处理 mRNA样品时必须仔细小心。(3) 由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。(4) 文库构建要选择合适的载体，常规用的是入噬菌体，这是因为 入DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。(5) 胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCI浸泡过夜。(6 )胶回收时电压要稳定。2总结获得目的基因的方法。一、直接

23、获取1从基因文库中获取(用限制性内切酶直接获取法)。利用入噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：选用特定限制性内切酶，DNA进行部分酶解，得到 DNA限制性片段 选用适当的限制性内切酶酶解 入噬菌体载体DNA。经适当处理，将基因组DNA 限制性片段与入噬菌体载体进行体外重组。利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。2.CDNA文库法(反转录法)。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真

24、核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列， 即不能表达真核生物 DNA。而在真核生物成熟 mRNA中已不存在间隔序列 (已在拼接过程 中被去除)，所以可以以真核生物成熟 mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表 达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。3鸟枪法(散弹射击法)。用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别

25、转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA (外源DNA )的所有片段分别在受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定 的方法吧带有目的基因的 DNA片段分离出来。用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简 便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。二、人工合成1通过DNA自动合成仪，用固相亚磷酸酰胺法合成，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。2.聚合酶链反应(Polymerase Cha in Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等

26、突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。第十三章1. 描述根癌农杆菌介导的已基因转化过程。(1 )农杆菌对受体的识别；(2 )农杆菌附着到植物受体细胞；(3 )诱导和启动毒性区基因表达；(4) 类似结合孔复合体的合成和装配；(5) T-DNA的加工和转运；(6) T-DNA的整合；(7) 股(T Strand)转入植物细胞，整合到寄主基因组中;(8) T DNA基因表达，使植物细胞增殖并产生冠瘤碱。2. Vir区表达的蛋白是如何发挥其生物学作用

27、的？答：受伤植物产生酚类物质 (如烟草组织产生的乙酰丁香酮)t诱导Ti中VirA基因的表达,编码一种结合在膜上的化学信号受体蛋白tVirA受体蛋白C端活化，组氨酸残基磷酸化t激活VirA蛋白t磷酸集团转移至VirG t VirG编码DNA结合活化蛋白t VirG蛋白结合于vir启动子的特定区域t作为转录激活因子，打开VirB、VirD、VirE基因簇。3什么是报告基因？报告基因应具备的条件？答：报告基因是指其编码的产物能够很快被测定、常用于判断外源基因是否成功导入受体细胞(器官或组织)，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它的应用不依赖于外界选择压力 的存在。既可以作为一种转基因的鉴定方法，也可

28、以作为转基因帅选的一种手段。*理想的报告基因的基本要求：(2)它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞；(1)受体细胞中不存在相应的內源等位基因的活性；(3 )具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。第十四章1. 比较： gene kno ck-out, knock in and knock dow n:答：基因敲除(gene knock-out)是针对序列已知功能未知的序列，以同源重组的手段，用 外源基因来替换所检测的内源基因，从而通过筛选重组体，检验并推测该片段的生物学功能。基因敲除的载体一般由两段与基因组内靶基因座序列同源的DNA片段组成，中间为正向标记，同源臂外侧为负选择基因。基因敲入(gene knock in)是利用基因同源重组，将外源基因(基因组原先不存在、或已失 活的基因)，转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获 得表达的技术。敲入结构类似于敲除载体，区别在于：或用外源基因替换并失活靶基因，或 在不影响靶基因功能的情况下插入新的基因，或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从而实现基因