香菇菌丝原生质体制备与融合条件的研究

1、香菇菌丝原生质体制备及融合条件的研究李蕤， 马守能，刘群， 吴克， 刘斌， 潘仁瑞（合肥联合大学化学与生物工程系， 安徽 合肥230022 ）摘要： 讨论不同菌龄、 酶解时间、酶解温度、 渗透压稳定剂对香菇原生质体产率的影响。结果表明，香菇菌丝制备原生质体时最适菌龄为6天， 酶解时间为3h， 酶解温度为34c， 渗透压稳定剂用0. 6moi /l甘露醇为最佳。在此基础上， 以 35%的 peg为融合诱导剂进行香菇b01、 l26 种间原生质体融合， 并用显微镜观察到融合子的形成。关键词：香菇； 原生质体；融合中图分类号：s646文献标识码：a文章编号：1000- 2162 （2001） 03-

2、 0099- 05!引言目前我国香菇占有50%以上的国际市场， 具有巨大的经济价值，因此，通过育种方法提高香菇产量和质量是必要的。近30 年来， 我国进行香菇育种的主要途径是自然选育和杂交育种。细胞融合 （即原生质体融合） 尚在试验探讨阶段， 并被证明是一种行之有效的育种新方法1 - 3。优良原生质体制备条件的选择是开展以原生质体为材料育种工作的基础。本试验对香菇原生质体制备、融合的影响条件进行了研究，为香菇原生质体融合育种提供了试验依据。实验方法 .材料1.1.1供试菌种香菇 b01 菌株、 香菇 l26菌株，均由安徽合肥九0 一食用菌厂提供。1.1.2培养基4、5母种培养基pda： 马铃薯

3、 200g； 葡萄糖 20g； 琼脂 20g ； 水 1000ml液体扩大培养基pd：pda去掉琼脂 .#溶液的配制61.2. 1稳定剂0. 6moi /l 甘露醇渗透压稳定剂；0. 6moi /l 蔗糖渗透压稳定剂；0. 6moi /lmgso4渗透压稳定剂。1.2.2缓冲液0. 1moi/l 的柠檬酸溶液； 0. 2moi/l 的 na2hpo4溶液； ph 为 5. 6 的柠檬酸 - na2hpo4缓冲液。1.2.3酶制剂的配制溶壁酶 （ lywaiizyme ）（由广东微生物研究所生产）： 用 0. 6moi/l 的上述渗透压稳定剂和ph 为 5.6 的柠檬酸- na2hpo4缓冲液等

4、比例混合，配制成浓度为1. 5%收稿日期：2000- 12- 18基金项目：合肥联合大学科研基金资助项目（200012 ）作者简介：李蕤 （1959- ） ， 女， 安徽合肥人，合肥联合大学讲师.2001年 9 月第 25卷 第 3 期安徽大学学报 （自然科学版）journai ofanhui universitynaturaiscienceeditionseptember 2001voi.25 no.3的高渗酶解液， 再用 0.45!m 微孔膜过滤除菌。1.2.4助 融 剂 的 配 制分 别 称 取 聚 乙 二 醇 （ peg， 平 均 分 子 量 4000） 3. 5g 和 分 析 纯ca

5、ci21.5g于烧杯中，溶解后移入100ml 容量瓶定容， 再用 0. 2moi/l 的三 （羟甲基） 氨基甲烷溶液滴定至p7.0 。1.3方法1. 3.1菌丝的培养和纯化用 pda作为母种培养基， 液体扩大培养时， 在 250ml 三角瓶中到入 80mlpd培养基，接种后，在 25c 恒温培养箱中静至恒温培养。用灭过菌的纱布过滤收集菌丝，先后用无菌水、 0. 6moi/l 的渗透压稳定剂多次洗涤，4000r/min 离心 15min， 弃去上清液， 用吸水纸将水分吸干。1.3.2原生质体的制备和纯化加酶量按菌丝体 （g） 1酶 （ ml）= 118 置于直径5cm的无荧光平皿中，轻轻摇散菌丝

6、， 在恒温培养箱中28 - 34c 酶解 2- 5h， 每 30min 取样一次， 在倒置显微镜下检查原生质体的数量，最后加入渗透压稳定剂终止反应。酶解结束后， 用 g2沙芯漏斗过滤脱去残留的菌丝断片，滤液 3000r/min 离心 10min。沉淀的原生质体用渗透压稳定剂清洗离心两次以后，并悬浮于高渗营养液中，即得纯化的原生质体， 并用血球计数板计数。1.3.3原生质体的融合与再生将香菇b01 菌株和l26 菌株的原生质体以一定的浓度（至少 1x106个 /ml） 等量混合3000r/min 离心 10min， 去上清液， 并加入35% 的助溶剂， 于25c 保温 30min， 再离心去掉上

7、清液， 沉淀用渗透压稳定剂洗涤几次以除去peg.最后的沉淀经适当稀释后， 置再生培养基上培养， 使融合子得以再生。!实验结果与讨论! .香菇菌丝菌龄对原生质体制备率的影响实验中我们发现香菇菌丝菌龄对原生质体制备率的影响较大。其结果如图1 所示，从图 1 中可见，香菇 b01 菌株培养 6d 的菌丝菌龄， 其原生质体释放率最高，而香菇 l26 菌株培养 5d 的菌龄最佳。因此， 在原生质体的制备过程中菌丝菌龄过大或过小都将影响原生质体的制备量。一般以对数生长期的幼嫩菌丝酶解制备原生质体效果最好。图 1香菇菌丝菌龄对原生质体制备率的影响注： 以上数据均是在34c ， p5.6 ， 以 0.6moi

8、 /l 甘露醇为渗透压稳定剂，1.5% 溶壁酶，酶解 2.5h 所得结果。001安徽大学学报（自然科学版）第 25 卷! .!酶解时间对香菇原生质体制备率的影响将菌丝放在直径5cm的无荧光平皿中， 做酶解时间对原生质体制备率的影响，并置于倒置显微镜下观察， 并随时测原生质体数。如图2 所示。图2酶解时间对香菇原生质体制备率的影响注： 在 34c ， ph5.6 下， o.6moi/l 甘露醇为渗透压稳定剂，l. 5% 溶壁酶，在不同酶解时间所测得的原生质体数。图2中结果表明， 香菇bol原生质体制备率3h达最大值；l26菌株2. 5h即达最大值。之后随时间的增加原生质体制备率皆不增加。这是香菇

9、菌丝在一定时间内已得到充分酶解， 而继续酶解， 不但不能增加原生质体的数目，反而造成原生质体的溶解，使原生质体数目减少。从图3、 图 4 中可见，酶解 lh 的菌丝体酶解液中已产生一定量的原生质体，但酶解液中仍有许多未被酶解的菌丝。当酶解3h 后的原生质体数量明显增多，此时经纯化得大量原生质体。图 4香菇菌丝原生质体图 3酶解中的香菇菌丝! .酶解温度对香菇原生质体制备率的影响为了便于对酶解的观察，同时对原生质体数量进行测定，本实验在直径5cm的无荧光平皿中进行。因此用恒温培养箱来对温度进行控制。实验数据如表l 所示。l ol第 3 期李蕤， 等： 香茹菌丝原生质体制备及融合条件的研究表 i酶

10、解温度对香菇原生质体制备率的影响数据表（单位： i07个 /ml）菌株28c30c32c34c36cb0i3.756.036.647.7i4.32l264.456.788.387.354.70实验结果表明， 香菇 b0i 菌株在 34c 时酶解制得原生质体数最多，l26菌株在 32c 时酶解制备最高。另外从表i 数据中可以看出酶解温度控制在30 - 34c 对香菇 b0i、 l26 菌株制备原生质体的影响不太大。! .渗透压稳定剂对香菇原生质制备率的影响渗透压稳定剂对细胞壁溶解酶活性有调节作用，另外对生成的原生质体有一种稳定和保护作用。本实验分别称取0. 075g溶壁酶，配制成三种不同的高渗酶

11、解液，在34c，ph为5.6 下， 酶解 2.5h， 实验数据如表2。表 2渗透压稳定剂对香菇原生质制备得率的影响（单位： i07个 /ml）菌株0.6moi/l 甘露醇0.6moi/l 硫酸镁0.6moi/l 蔗糖b0i2.6i3.55i.27l264.322.23i.i5从表 2 的结果可以看出， 0.6moi/l 的蔗糖渗透压稳定剂在制备香菇原生质体时不适合，香菇 b0i 、 l26 菌株菌丝制备原生质体时分别用0.6moi/l 硫酸镁和甘露醇作渗透压稳定剂，其制备率最高。! .#香菇原生质体融合显微观察用 i.3.3方法进行香菇b0i 菌株与 l26 菌株原生质体种间的融合；对融合子形

12、成进行显微观察，其显微照片如图5 所示。图 5香菇原生质体的种间融合子从图 5 中可见，香菇种间原生质体经peg促融后，在 ca2+存在下，香菇 b0i、 l26的原生质体俩俩吸附、 融合、 形成八字形， 最终形成融合子。20i安徽大学学报（自然科学版）第 25 卷参考文献：1 刘振岳 . 平菇与香菇融合子的综合鉴定j . 食用菌， 1994 ， （4） ： 5 - 6.2 刘振钦 .平菇和榆黄蘑原生质体分离与融合的研究j .食用菌，1996 ， （1） ： 13- 14.3 贺建超 .侧耳属种间原生质体融合的研究j .食用菌，1995 ，（2） ： 11- 12.4 杨新美 . 食用菌研究法

13、m .北京： 中国农业出版社， 1998 ， 200 217.5 崔文留 . 香菇的原生质体融合育种技术j .食用菌， 2000，（1） ： 11- 12.6 李 刚 . 灵芝原生质体分离与再生研究j . 菌物系统，1999 ， 18 （1） ： 79- 88.studies on the preparation and fusionof protoplast from lentinula edodeshyphaeli rui， ma shou- neng， liu oun， wu ke， liu bin， pan ren- rui（the chemistryandbiotechnoiogyd

14、epartmentofhefei unionuniversity ，hefei230022 ， china ）abstract： the infiuence ofdifferent ceii age ，enzymoiysis time，temperatureandosmotic pressurestabiiizeronproductiverate ofprotopiast fromlentinula edodeswerediscussedin this paper. it is thebestconditions ofpreparingprotopiast with lentinula edo

15、des hyphaethatceii agewas6 days ，thaten-zymoiysis time was3 hours ，that enzymoiysis temperaturewas34c and that concentration ofmannitoias osmotic pressurestabiiizerwas0.6moi/i. in addition ，the protopiast fromlentinula edodes b01andl26 werefusedwith 35% poiyetiyienegiycoi（peg）soiution asfusioninduce

16、rand formation offusantwasobserved underthe microscope.key words： lentinula edodes ； protopiast； fusion301第 3 期李蕤， 等： 香茹菌丝原生质体制备及融合条件的研究香菇菌丝原生质体制备及融合条件的研究作者：李蕤， 马守能， 刘群， 吴克， 刘斌， 潘仁瑞作者单位：合肥联合大学刊名：安徽大学学报(自然科学版)英文刊名：journal of anhui university年，卷(期)：2001,25(3)被引用次数：4次参考文献(6条)1. 刘振岳 平菇与香菇融合子的综合鉴定 1994(0

17、4)2. 刘振钦 平菇和榆黄蘑原生质体分离与融合的研究 1996(01)3. 贺建超 侧耳属种间原生质体融合的研究 1995(02)4. 杨新美 食用菌研究法 19985. 崔文留 香菇的原生质体融合育种技术 2000(01)6. 李刚 灵芝原生质体分离与再生研究 1999(01)本文读者也读过(10条)1. 焦海涛 . 杨先新 . 周伟. 王群. 张顺凯 . 罗信昌 香菇原生质体单核体杂交方法试验期刊论文-中国食用菌 2002,21(6)2. 杨土凤 . 王立洪 . 杨涛. 龙章富. yang tu-feng . wang li-hong . yang tao . long zhang-fu

18、平菇与香菇原生质体融合新菌株的生物学特性研究期刊论文-四川大学学报（自然科学版）2010,47(1)3. 鲍大鹏 . 谭琦. 吴国富. 潘迎捷 香菇孢子单核体原生质体的制备和再生的研究期刊论文-中国食用菌2000,19(6)4. 甘炳成 . 唐家蓉 . 彭卫红. 郭勇. 谢丽源. 肖在勤. gan bing-cheng. tang jia-rong . peng wei-hong .guo yong . xie li-yuan . xiao zai-qin香菇单核原生质体杂交菌株 jw 系列的选育研究期刊论文-西南农业学报 2006,19(3)5. 付成 香菇优良杂交菌株初步筛选及其杂交群体遗传分析学位论文20096. 王澄澈 . 梁枝荣 . 苗艳芳. wang cheng-che . liang zhi-rong . miao yan-fang香菇原生质体诱变育种初报 期刊论文-西北农业大学学报 2