试验十薄层色谱和柱色谱

1、实验十薄层色谱和柱色谱1. 实验目的 了解薄层色诺和柱色谱的基本原理； 学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术2. 实验原理 色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。其基本原理是利用混合物中 各组分在某-物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物 的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合物 溶液称为流动相：固定的物质称为固定相（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的 作用原理不同，可分为吸附色i普、分配色谱等。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相： 分配色i普中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相

2、，而支 持剂本身不起分离作用。根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相 色谱及高效液相色谱等类型。 薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，北石设备简单、 速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。适用于小量样品（几 到几十微克，甚至0.01/的分离。此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生 变化而不能用气相色谱分析的物质。其可分为吸附色谱和分配色谱。由于不同组分被固 定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而 形成了互相分离的斑点溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 Rf=溶剂前沿至原点中心的距离*层色

3、谱用的吸L，'.和义扑剂：薄用色吸常用的吸附剂或支扑剂是硅胶或氧化铝。薄层 色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂：硅胶G含燃石有做粘合剂：硅胶HF-254含荧光 物质，可在波长25如n紫外光下观察荧光;硅胶GF-254含有照石膏和荧光剂。薄层色 诺用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。薄层板的制备：简易平铺法，如称取约3g硅胶G,加入到6 7mL 0.5%的蔑甲基纤维 素钠水溶液中，调成均匀的糊状物（可铺7 8张载玻片）。这一步一定要将吸附剂逐渐 加入到溶剂中，边加边搅拌：如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。然后采用和倾 斜法将糊状物涂布在干净的载玻片上，制成薄层

4、板。薄层板的活化：涂好的薄层板室温水平放置晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根 据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105 U0-C活化30mino氧化铝板在 200 220°C烘4h可得活性II级的薄板。150 160#C烘4h可得活性III IV级的薄板。薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而卜降。注意硅胶板活化时温度不 能过高，否则硅酿基会相互脱水而失活。活化后的薄层应放在干燥器内保存。点样：将样品溶于低沸点溶剂（丙酮、甲隔、乙隔、觑仿、苯、乙酰和四氯化碳）配成1% 的溶液，用内径小于hum管口平整的毛细管点样：用毛细管取样品溶液，在薄层板一端 约1.0cm

5、处，垂直地轻轻地接触到薄层上的吸附剂，样品溶液就可靠到薄层上。在薄层 色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、 吸附剂的种类、薄层的厚度均仔关系。样品太少，斑点不清楚，雄以观察；样品岚太多， 往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。若因样品溶液太稀，可重殳点样，但应 侍前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，样点直径一般以2 lim为宜。同一薄层上的 样点直径应一致。另外点样要轻，不可刺破薄层。展开：倾斜上升法：先将一定量展开剂放在色语缸中，盖上缸盖，再将点好试样的薄层 板样点一端朝卜放入缸内，盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分 随展开剂在薄层

6、中以不同的速度自卜而上移动而导致分离。当展开剂前沿上升到样点上 方8 10cm时取出薄层板，放平，铅笔标明溶剂前沿位置，冷风吹干溶剂。显色：展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时，可直接观察。若化合物本身无色，可 在紫外灯卜.观察荧光斑点，也町用显色剂显色。简单常用的显色剂是碘蒸气，广II瓶中 放置少量碘晶体，使用时将薄层板放入，盖上瓶盖，密封瓶内的碘蒸J即订使大部分有 机化合物显色（饱和炷与卤代炷除外）。 柱色谱：原理与薄层色谱类似，常用的有吸附色i普和分配色谱两类。吸附柱色诺通常在 玻璃管中填入表面枳很大的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附 柱时，各种成分同时被吸附在柱的上

7、端。当洗脱剂流卜时，由于不同化合物吸附能力不 同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂 的亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，己经分开的溶质可以从柱上分别洗 出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将务色带中的溶质萃取出来。吸附剂：实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。吸附剂的选择一般要根据待分离的化合物 类型而定。例如硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，略具酸性，适合于极性较大 的物质分离：同时硅胶极性相对较小，适合于分离极性较大的化合物，如枝酸、醇、酯、 桐、胺等。而氧化铝极性较强，对于弱极性物质具有较强的吸附作用，适合于分离极性 较弱的化合

8、物。酸性氧化铝适合于分离段酸或氨基酸等酸性化合物：碱性氧化铝适合于 分离胺；中性氧化铝则可用于分离中性化合物。大多数吸附剂都能强烈地吸水，且水分 易被其它化合物置换，因此吸附剂的活性降低。因此吸附剂使用前一般要经过纯化和活 性处理，颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高， 但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。溶质结构与吸附能力的关系：化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中岔仃 极性较大的基团时，吸附性也较强，各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：酸 和碱隔、胺、硫脖能、醛、酮芳香族化合物卤代物、酷烯饱和炷溶剂：柱色诺分离中，洗脱

9、剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各化合物的极 性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。但是必须注意，选择的洗脱剂极性不能大于样品 中各组分的极性。否则样品组分在柱色谱中移动过快，不能建立吸附-洗脱平衡，影响 分离效果。实际操作时，一般采用薄层色谱反夏对比、选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层 色谱上将样品中各组分完全分开，即可.作柱色谱洗脱剂。在有多种洗脱剂诃选择时，一 般选择目标组分Rf值较大的洗脱剂。-般来说，洗脱剂都需要采用混合溶剂，利用强 极性和弱极性溶剂复配而成。：硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱，洗脱剂的洗脱能力 仃如卜顺序：己烷和石油SIV环己烷V四氯化碳V三氯乙烯V二硫化碳V甲苯V苯V

10、二筑甲烷V氯仿V乙酷V乙酸乙酯V丙酮V丙醇 乙醇 甲醇V水VI也症V乙酸。3. 实验药品和仪器偶翅苯的苯溶液，苏丹II的苯溶液，苏丹III的苯溶液，乙醇，石油酷，亚甲基蓝和 荧光黄的混合溶液薄层板，色诺柱，漏斗，毛细管4. 实验步骤 点样：在薄层板距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线，取毛细管插入样品溶液中，在一块 板起点线上点偶氮苯、苏丹II、混合液三个样本点，在第二块板起点线上点偶额苯、苏 丹III、混合液，第三块板上点偶氮苯、未知样、混合液。 在缸内配置乙醇和石油酷4:1的混合溶液作为展开剂，待样点干燥后，将薄层板放入展 开。观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升

11、的前沿处 划一记号，比较二者Rf值的大小。(3)在色谱柱内依次加入0. 5cm厚的石英砂、到柱高3/4处的氧化铝、0. 5cm厚的石英砂， 填装紧密。将烧杯置于色谱柱卜.端，将乙院加入色谱柱至没过表面。当液面下降至氧化 铝上端表面时，加入亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液。用乙醇淋洗保持湿润，直至观察到 色层带的形成和分离，改用乙醇与水的混合溶液淋洗，分层明显后再换用水淋洗。当亚 甲基蓝带到达柱底时，立即换另一接收器，收集全部此色层带，然后换另一接收器收集 荧光黄色层带。5. 实验注意事项 色谱柱填装的紧密与否，对分离效果很有影响。若柱中气泡或各部分松紧不均时，会影 响渗透速率和显色均匀。但如果过分敲

12、击，又会因为太紧密二流速太慢。 为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶 剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。6, 实验数据记录与处理7. 实验思考与讨论 在一定操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？答：在特定的展开剂中，Rf值几乎可以认为是物质的特性之一。取标准品和样品，如果 在两个以上的展开剂系统中，样品都有和标准品相同Rf的点，基本可以确定样品中含 任标准品。如果样品在多种展开剂中，都显示只有一个点，而这个点的Rf和标准品（或 名报道的标准品的）Rf总是相同，那么此样品就是标准品所含物质。TLC用于鉴定，是 最简便而又常用的方法之一 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？答：薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品的极性，溶解度和吸附剂的活 性等因素来考虑。凡溶剂的极性越大，则对化金物的洗脱力也越大，也就是说Rf值也 越大，（如果样品在溶剂中有一定溶解度）。因为根据溶剂的极性，化合物的极性及Rf 值，可知各组分在薄层板上的位置。 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色诺有何影响？答：这样所点试样将被