透析方法简介

1、生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用 的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩 样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内， 将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不 断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留波，袋（膜）夕卜的溶液称为&

2、quot;渗出液”或”透析液”。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4C透析，升高温度可加快透析速度。透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国UnionCarbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO （即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10%的甘油处理过，并含有极微量

3、的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50%乙醇煮沸1小时，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸熠水冲洗即可 使用。实验证明，50%乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4 C蒸熠水中，若长时间不用，可加少量NaN2,以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸熠水洗净，即可使用。使用时， 一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一

4、端灌满水，用手指稍加压，检查不漏， 方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的 水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50%是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量 筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋 沉入液面以下。检查透析效果的方法是：用 1 % BaCl2检查（NH4）2SO4，用1 % AgNO3检查NaCl、KCl等。 为了提高透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设

5、计与制作各种简易的透析装置。美国 生物医学公司（Biomed Instruments Inc.）生产的各种型号的 Zeineh透析器，由于使用对流透析的原理，使 透析速度和效率大大提高。3. 超滤超过滤即超滤，自20年代问世后，直至 60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展 成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各 种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超

6、滤根据所加的操作压 力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4X104 Pa,膜的平均孔径为500埃14微米（1微米=104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。 超滤所用操作压为4X104 Pa7X105 Pa,膜的平均孔径为10-100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用的 操作压比超滤更大，常达到 35X105 Pa140X105 Pa,膜的平均孔径最小，一般为 10埃以下，用于分离小 分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变

7、化，而且不引起温度、 活和自溶。pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050%的浓度。超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同 性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05mm和0.025mm。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜，其中一种各向异性扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔"皮肤层"（厚约0.1mm1.0mm ），和一层相对厚得多的（约 1mm ）

8、更易通渗的、作为支撑用的 "海绵层”组成。皮肤层 决定了膜的选择性，而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄，因此高效、通透性好、流量大，且不 易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为 适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砚膜、聚砚酰胺膜和聚丙烯腊 膜等。这种膜在pH 114都是稳定的，且能在 90C下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当， 能连续用12年。暂时不用，可浸在 1%甲醛溶液或0.2 %叠氮化钠NaN3中保存。超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/（cm2h）;截留率（以百分率

9、表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类 型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘 附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可 加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。国内主要的研究机构和生产厂家是：中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究 所、无锡化工研究所、上海医药工业研究所、天津膜分离

10、工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种，以及从 某些研究工作的深度方面看，我国与世畀先进国家的差距不很大，但在膜的质量性能及商品化方面尚有较 大差距。在生物制品中应用超滤法有很高的经济效益，例如供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铉盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铉耗量大，能源消耗多，操诈 时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18% ;吸附损失为1.69%;透过损失为1.23%;截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节

11、省硫酸铉 6.2吨，自来水16000吨。超滤技术的应用有很好的前景，应引起足够的重视4. 冰冻干燥冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终 产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活， 通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。透析袋和透析膜处理方法 使用前处理：1. 把透析袋剪成适当长度(10-20cm )的小段。2. 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0) 中将透析袋煮沸10分钟。3. 用蒸储水彻底清洗透析袋。4. 放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸 10分钟。5. 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须 戴手套。6. 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。透析膜(前处理方法如下):1. 戴手套把透