液相色谱条件的分析和建立PPT课件

1、2021/7/231液相色谱条件的分析和建立主讲人 :李效宽日期 : 2010年11月地点：武汉2021/7/232合适的流动相合适的流动相合适的色谱柱合适的色谱柱合适的分离度合适的分离度较好的色谱峰型较好的色谱峰型重现的色谱图重现的色谱图2021/7/233 HPLC分分离原理离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件)2021/7/234不同类型样品的方法选择样品首选方法弱极性反相色谱极性正相色谱，未修饰硅胶高分子量凝胶色谱，尺寸排阻，离子

2、交换光学异构手性柱无机盐混合物离子色谱碳水化合物氨基柱（反相），离子交换树脂2021/7/235色谱柱的选择 根据分离方式分类根据分离方式分类 (1)正相色谱：正相色谱：SiO2； CN；NH2 (2)反相色谱：反相色谱：C18；C4；C8；CN；NH2 ；苯基苯基 (3)离子交换色谱：离子交换色谱： 阳离子官能团：阳离子官能团：SO3H磺酸基、磺酸基、COOH羧基等羧基等 阴离子官能团：阴离子官能团：R4N季铵基、季铵基、-氨基等氨基等 (4)凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（GFC）；）； 油溶性凝胶渗透（油溶性凝胶渗透（GPC） (5)其它类型：手性柱等其它类型：手性柱

3、等2021/7/2361.填料基质：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等 3.孔径：60-100A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析）， 10mm以上（制备） 6.长度：100、150、250、300mm色谱柱选择2021/7/237色谱柱填料选择 粒度均匀（3，3.5, 5 um), 粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。 低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾 宽的pH 范围，可以有较大的调节自由度2021/7/238色谱柱选择 长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长 内径：

4、2mm,4.6mm,10mm 粒径：3um, 3.5um, 5um 孔径：100A,300A2021/7/239 流动相选择 溶 剂 截止波长(nm) 水 190 乙腈 190 甲醇 210 乙醇 210 异丙醇 210 正己烷 210 四氢呋喃 210 二氯甲烷 240 氯仿 240 2021/7/2310甲醇和乙腈的紫外吸收图线性范围和检出限度都有影响2021/7/2311不同混合溶剂的粘度比较2021/7/2312分离度（R1.5）和峰型（1.05T0.95）2021/7/2313可接受的分离条件K 可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。 K=(tr-t0)/t0

5、T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间 K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。2021/7/2314理论塔板数2021/7/2315分离度 w1 ,w2是峰1峰2的基线宽度 W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2 的半高峰宽2021/7/2316分离度与k（容量因子）的关系 所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10 方法：有机相100%,90%,80%,70 每减少10%,k值变化为2.53倍2021/7/2317分离度80%-70%-60%2021/7/2318分离度（48%-47%-46%)2021/7/2319更换有机相 a :甲醇-水 b:THF-水

6、c:甲醇：THF:水2021/7/2320总结 1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受 2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全 3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN 4 混合使用有机溶剂 记录每一次条件变化对谱峰的影响2021/7/2321其他控制选择性的因素 流动相pH值 柱温 不同品牌色谱柱 离子对试剂2021/7/2322流动相pH值 1,2 酸性化合物 4,5碱性化合物 3中性化合物 图中曲线的拐点为该化合物的pKa pH57之间会有较好的分离，5附近比较稳定2021/7/2323流动相pH值2021/7/2324流动相pH值2021/7/2325pH值的影响(pka) 一组

7、苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况 A: pH 2.5 B: pH 3.0 C: pH 3.5 D: pH 4.02021/7/2326pH值的影响 pH值必须在该缓冲盐的pKa1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差 由此得出磷酸盐缓冲液可用于pH 2.0-3.1,6.2.-8.2 醋酸盐缓冲液可用于pH 3.8-5.82021/7/2327方式不同柱效不同色谱条件色谱柱：Kromasil C18 4.6250mm 5um，柱温 ：室温，波长 ： 203nm流速 ： 1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相 0mi

8、n 20 : 80柱效:11500 20min 40 : 60人参皂苷Rg1 (样品) 柱效:60000min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A, Sig=203,4 Ref=360,100 (BUXINQIKF000001.D)14.538min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A, Sig=203,4 Ref=360,100 (BUXINQIKF000009.D)10.8382021/7/2328柱温的影响 温度变化1度，Rt变化13% A: 30 B: 35 C: 40 D: 45 温度控制对定量分析很重要20

9、21/7/2329更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱2021/7/2330更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱 由于更换色谱柱会影响峰的次序，所以这是最后的选择2021/7/2331流速的影响 A 3um dp B 5um dp C 10um dp 从左到右 1,2,4ml/min 改变流速对分离影响不大，但可以缩短分析时间2021/7/2332填料及外型影响 Dp ：2.5um,3.5um,5um,10um（柱压，理论塔板数） 长度： 20,30,50,100,150,250mm（柱压，理论塔板数） 内径：2.1,3.0,3.9,4.6 mm（线速度）202

10、1/7/2333 a 150mm P=1800psi b 250mm P=3000psi柱长与柱压和RT成比例2021/7/2334改变粒度，长度，流速 150-mm l, 3-m ， 1-mL/min ,1250psi 100-mm , 3-m ，1-mL/min ,825psi 100-mm , 3-m 2-mL/min ,1650psi2021/7/2335缓冲盐（离子强度调节）的影响0102015525300040 mM NH4OAc)30 mM NH4OAc20 mM NH4OAc色谱柱：Dionex acclaim C18， 5um，250*4.6mm流动相：CH3CN:(NH4O

11、Ac溶液,pH5.2） 20 : 80检测波长：280nm 流速：1.0ml/min1050mM浓度2021/7/2336检测器的影响0816412UV 220 nmELS detector123412352021/7/2337检测波长的影响051017210 nm246 nm265 nm285 nm1512345672021/7/23381.1.等度条件等度条件二二. .色谱条件的开发色谱条件的开发2.梯度条件梯度条件2021/7/2339色谱条件开发的目标 二高一低：专属性高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。 在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、合适的分离度。 2021/7/2

12、340等度洗脱的特点 优点优点 操作简单、方便操作简单、方便 重现性好重现性好 缺点缺点 不适合某些复杂物质不适合某些复杂物质2021/7/2341梯度洗脱的特点 优点优点 分离能力增加分离能力增加 检测灵敏度提高检测灵敏度提高 缺点缺点 仪器设备要求高仪器设备要求高 不适合某些检测方式不适合某些检测方式2021/7/2342等度和梯度获得柱效不同等度和梯度获得柱效不同色谱柱： Dionex acclaim C18，250*4.6mm ，柱温 ：25，波长 ：203nm流速 ： 1.0ml/min 样品：人参皂苷Rg1 1.等度：乙腈：水（22：78）为流动相2.梯度：乙腈：水为流动相 0mi

13、n 20 : 80 20min 40 : 602021/7/2343等度和梯度获得柱效不同等度和梯度获得柱效不同min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A, Sig=203,4 Ref=360,100 (BUXINQIKF000001.D)14.538min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A, Sig=203,4 Ref=360,100 (BUXINQIKF000009.D)10.838柱效2.1万柱效6万2021/7/2344艰难的选择 分离度 分析时间 系统压力 在三者之间作出最符合实际情况的选择2021/7/2

14、345快速寻找方法的起点 传统的建立方法模式需要较长的时间，100%，90% 现代仪器多为三元或两元泵系统，可以方便的在整个流程中自由的变化比例，因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。2021/7/2346确定梯度运行的方法 设计一个30分钟的运行，推荐条件： 250*4.6mm 5um 1.0ml/min 甲醇 0 min 5% 30 100% 35 100% 2021/7/2347一个实例 tg 第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差 Tg 整个梯度运行时间 tg/tg0.4 梯度 tg/tg=（28.6-18.3)/30=0.34， 因此可以分别尝试2021/7/2348由梯度变换为等

15、度 平均保留时间t=(18.3+28.6)/2=23.5t=(18.3+28.6)/2=23.5 陡度陡度=(100-5)/30=3.17=(100-5)/30=3.17 等度比例等度比例=5+3.17=5+3.17* *23.5=79%23.5=79%2021/7/2349等度（79%)运行结果（考虑K?）2021/7/2350由梯度变换梯度(K?) 第一个谱峰第一个谱峰18.3对应对应5+3.17*18.3=63% (18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1 (K=1) 最后一个谱峰最后一个谱峰28.6对应对应5+3.17*28.6=95% 梯度时间为梯度时间为 100-

16、5 =95-42 30 X X=16 min 陡度不变2021/7/2351第二次梯度运行结果 Time B% 0 42 16 95 20 95 2021/7/2352液相色谱的方法开发（二）梯度方法2021/7/2353梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）2021/7/2354梯度一般方法2021/7/2355梯度洗脱的可变参数 梯度的陡度 梯度的变化形状124356789 10 112021/7/2356如不用梯度：分离不理想2021/7/2357梯度条件的优化梯度曲线压力曲线

17、2021/7/2358梯度曲线的变化 凹线2021/7/2359梯度曲线的变化 凸线2021/7/2360梯度方法开发实例 - 第一步 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。2021/7/2361梯度方法开发实例 - 第二步 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。2021/7/2362梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个

18、杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。2021/7/2363梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。2021/7/2364梯度方法开发实例 - 第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。2021/7/2365梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。2021/7/2366

19、梯度方法开发实例 - 第七步 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。2021/7/2367三三. .实际应用案例实际应用案例2021/7/2368色谱应用实例欣弗事件色谱柱： Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um （国家标准）流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用磷酸调pH值至2.5)-乙腈检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min克林霉素磷酸酯 0.02.55.07.510.012.515.017.522.0-1020406080100120注射用克林霉素磷酸酯 #57有关物质(775:225)UV_VIS_1mAUmin1 - 3

20、.2522 - 5.0693 - 6.7324 - 7.0285 - 7.6386 - 9.2117 - 13.180WVL:210 nm0.05.010.015.020.025.030.035.043.0-5.010.020.030.040.050.060.0注射用克林霉素磷酸酯 #61有关物质(82:18)UV_VIS_1mAUmin1 - 2.7012 - 3.2423 - 4.1654 - 9.1675 - 14.4876 - 15.9247 - 16.7108 - 19.8989 - 21.33910 - 32.263WVL:210 nm775 22582 182021/7/2369

21、色谱应用实例欣弗事件色谱柱： Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um 流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用40%氢氧化钾调pH值至5.6)-乙腈(775225)为流动相 检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min 分离度大于6min0510152025Norm.-1001020304050 2.452 2.995 5.548 6.555 8.536 9.546 10.939 27.293min0510152025Norm.020406080100 DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (KELMSHLFF0003.D)

22、 2.430 10.587 25.994克林霉素磷酸酯 克林霉素C H2OOH3COOOO-OO-OOC H3H+K+2021/7/2370色谱应用实例【三聚氰胺(牛奶事件)色谱柱： Venusil ASB-C18 4.6*250,5um; （FDA标准）流动相：(10mM 柠檬酸，10mM 辛烷磺酸钠，调pH 为3.0)：乙腈=85：15检测波长：240nm 柱温：40 流速：1.0ml/min分 子 式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 分 子 量：126.12 含氮量：66.6%2021/7/2371色谱应用实例（紫杉醇 注射液）min0102030405060Norm.-10010

23、20304050 1.188 26.805 47.219 50.764 55.808 56.110 56.420 56.739 57.067 57.396色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm （黄金植物）流动相：乙腈-水（40：60），洗脱至主峰出完（约27分钟），然后以每分钟1.6%的速度增加乙腈的比例，25分钟后，乙腈比例增至80%，再以每分钟4%的速度降低乙腈的比例，10分钟后，乙腈比例降至40%，保持此比例10分钟。 检测波长：227nm 流速：1.0ml/min紫杉醇 2021/7/2372色谱应用实例（紫杉醇 注射液）min02468101214Norm

24、.-1001020304050 5.681 11.948色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm流动相：甲醇-水-乙腈（30：40：30） 检测波长：227nm 流速：1.0ml/min炔诺酮 紫杉醇 2021/7/2373色谱应用实例（血塞通崩解片）min0510152025Norm.02505007501000125015001750 2.329 3.024 4.888 8.818 9.982 18.120 19.934 21.878色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：203nm时间（min） 乙腈 水0 20% 80%20 40

25、% 60%21 20% 80%26 20% 80%三七皂苷R1人参皂苷Rg1 人参皂苷Rb1 2021/7/2374色谱应用实例（胆酸钠原料）min01020304050mAU0100200300400 11.377 14.152 16.194 19.479 20.158 22.628 24.244 25.947 27.939 35.538123456s色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：205nm时间（min） 乙腈 0.2%磷酸二氢钾溶液(磷酸调PH值至2.5) 0 25% 75%30 40% 60%40 40% 60%50 25% 75%指纹图谱202

26、1/7/2375色谱应用实例（抗生素）色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：254nm流动相：乙腈：（三乙胺14ml，加水100ml, 醋酸调PH值至2.5)=18：82流速：1.0ml/min 样品：注射用头孢哌酮钠对照品样品1.头孢哌酮降解物B2.头孢哌酮3.头孢哌酮S异构体2021/7/2376色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/

27、min （杂质A+光照）min0510152025303540Norm.-1001020304050 DAD1 A, Sig=267,4 Ref=off (CHANGCHYG000000.D) 3.098 12.591 13.557 14.887 17.0452021/7/2377色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （样品）min0510152025303540

28、Norm.-1001020304050 3.117 8.982 14.7212021/7/2378色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （中间体+样品）min0510152025303540Norm.050100150200250300350400 5.424 6.110 7.552 9.536 11.778 14.169 15.8062021/7/2379色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （样品光照）mi