常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学

1、(二）聚合酶链式反应（二）聚合酶链式反应（PCR） PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性（三）单链构象多态性 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCRSSCP技术。（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照

2、DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）（五）DNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）（六）DNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。第一节分子杂交与印迹技术、探针技术分子杂交与印迹技术、探针技术一、分子杂交与印迹技术的原理在在DNA变性后的复性过程中，如果将不变性后的复性过程中，如果将不同种类的同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定溶液中，只要两种单

3、链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形成，也可以在之间形成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象称为核酸核酸分子杂交分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) (一)印迹技术 将各种生物大分子从凝胶转移到一种固将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过

4、程称为印迹技术定基质上的过程称为印迹技术（blottingblotting）。）。分子印迹分子印迹( (渍渍) )的概念的概念。 将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段变性使其成为单链，然后片段变性使其成为单链，然后再将一张硝酸纤维素再将一张硝酸纤维素(nitrocellulose(nitrocellulose， NC)NC)膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使管作用原理使DNADNA片段转移到片段转移到 NCNC膜上，使之成膜上，使之成为固相化分子。载有为固相化分子。载有DNADNA单链分子的单链分子的 NCNC膜就可膜就可以在杂交液与另

5、一种带有标记的以在杂交液与另一种带有标记的 DNADNA或或RNARNA分分子子( (即探针即探针) )进行杂交，具有互补序列的进行杂交，具有互补序列的RNARNA或或DNADNA结合到存在于结合到存在于 NCNC膜的膜的 DNADNA分子上，经放射分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。的区带。 由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为印迹技术。迹，因此称为印迹技术。 DNA 探探针针（DNA probe） ：将将一一小小段段已已知知序序列列的的多多聚聚 核核苷苷酸酸用用同同位位

6、素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标记记它它的的末末端端或或全全 链链后后就就可可以以作作为为探探针针，与与固固定定在在硝硝酸酸纤纤维维素素（NC）膜膜上上 的的 DNA 或或 RNA 进进行行结结合合反反应应。如如两两者者互互补补，就就可可以以在在 NC 膜膜上上形形成成相相应应区区带带，经经放放射射自自显显影影或或其其它它检检测测手手段段， 就就可可判判断断是是否否有有同同源源的的核核酸酸分分子子存存在在。 (二)探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷多聚

7、核苷酸酸，与固定在，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。是否有同源的核酸分子存在。因此印迹技术与探针技术往往同时使用。 分子杂交、印迹技术、探针技术实验分子杂交、印迹技术、探针技术实验目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析 (Western blotting) (一一) DNA印迹技术印迹技术(Southern印迹法印迹法 ) DNA印迹技术印迹技术是最经典的基因分析方法

8、，不但能检出特异的是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于段，而且能进行定位和测定分子量，可用于: 基因的酶切图谱分析、基因突变分析、基因组基因的定性及定基因的酶切图谱分析、基因突变分析、基因组基因的定性及定量分析、限制性片段长度多态性分析量分析、限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。等。为了纪念为了纪念Southern 先生，以其姓氏称先生，以其姓氏称DNA印迹技术为印迹技术为Southern blotting(Southern印迹法印迹法 )。(二二) RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于组织细胞中总用于组织

9、细胞中总RNA或或mRNA的定性的定性和定量分析。和定量分析。 其基本原理与其基本原理与DNA印迹技术类似。印迹技术类似。(三三)蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 三种印迹技术三种印迹技术放放射射自自显显影影照照片片目目 录录第第 二二 节节 PCR (PCR (聚合酶链式反应聚合酶链式反应) )技术技术的原理与应用的原理与应用 1993年年美国科学家穆利斯美国科学家穆利斯(K.Mullis)因发因发明明“聚合酶链式反应聚合酶链式反应”法，在遗传领域法，在遗传领域研究中取得突破性成就、加

10、拿大籍英裔研究中取得突破性成就、加拿大籍英裔科学家史密斯因开创科学家史密斯因开创“寡聚核甙酸基定寡聚核甙酸基定点诱变点诱变”方法而共同获得诺贝尔方法而共同获得诺贝尔化学奖化学奖。问题的提出？ 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵。 发现耐热DNA聚合酶Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每

11、个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。一、PCR技术的工作原理 PCRPCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成： 模板模板DNADNA的变性：的变性：模板模板DNADNA经加热至经加热至9393左右一定时左右一定时间后，使模板间后，使模板DNADNA双链解离，使之成为单链，以便它与双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；引物结合，为下轮反应作准备； 模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板模板DNADNA经加热变性经加热变性成单链后，温度降至

12、成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的单链的互补序列配对结合；互补序列配对结合； 引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保留复制链。链互补的半保留复制链。 重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸三过程，就可获得更多的延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新