基因工程育种PPT学习教案

1、会计学1基因工程育种基因工程育种主要内容主要内容第1页/共62页第2页/共62页Cohen和和Boyver l973年首次成功完成了年首次成功完成了DNA分分子 的 体 外 重 组 实 验 ， 宣 告 基 因 工 程子 的 体 外 重 组 实 验 ， 宣 告 基 因 工 程 ( g e n e engineering)的诞生，也为微生物育种带来了一的诞生，也为微生物育种带来了一场革命。场革命。 基因工程育种基因工程育种 广义的基因工程育种包括所有利用广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术重组技术将外源基因导入到微生物细胞将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的，使后者获得前者的某些某

2、些优良性状优良性状或者利用后者作为表达场所来或者利用后者作为表达场所来生产目生产目的产物的产物。第3页/共62页基因工程育种的优势基因工程育种的优势 与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，用基因工程方法，人们可以人们可以“随心所欲随心所欲”地进行自地进行自然演化过程中不可能发生的

3、新的遗传组合，创造全然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。新的物种。这是一种自觉的、能像工程一样事先进这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。种方法。第4页/共62页第5页/共62页第6页/共62页一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，的核酸内切酶，简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据根据限制酶的限制酶

4、的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类： 、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 第7页/共62页 限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片断，主要产生片断，主要产生3 3种缺口：种缺口： 5 5粘性末端粘性末端 3 3粘性末端粘性末端 平头末端平头末端 回文序列回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O旋转对称旋转对称; ; 粘性末端粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的5 5末端

5、突出或末端突出或3 3末端突出的碱基序列，相互具有互补性末端突出的碱基序列，相互具有互补性。第8页/共62页文艺控女生专属简单有范的个人签名文艺控女生专属简单有范的个人签名1、朝如青丝暮成雪。朝如青丝暮成雪。2、我们的爱情像萤石一样、我们的爱情像萤石一样美美3、或许时光匆匆只是你忘了带我走、或许时光匆匆只是你忘了带我走 -4、其实你并不知道在我心中你最美。、其实你并不知道在我心中你最美。5、你嘴、你嘴角角30度的微笑，百度搜索不到度的微笑，百度搜索不到6、我要变成一、我要变成一个可以让你永远感到温暖的小太阳个可以让你永远感到温暖的小太阳7、我用我、我用我千世万世的命，爱你千世万世。千世万世的命

6、，爱你千世万世。8、有的人像、有的人像风筝一样风筝一样 一断线就回不来了。一断线就回不来了。9、暗、暗里着迷里着迷10、我有两个影子，一个在、我有两个影子，一个在前，一个在后。伴我左右前，一个在后。伴我左右11、回忆起绽放的、回忆起绽放的那一个宁夏，仿佛可以触摸彩虹。那一个宁夏，仿佛可以触摸彩虹。12、早起、早起的时候发现下雪了，薄薄的淡淡的，挺美。的时候发现下雪了，薄薄的淡淡的，挺美。13、街灯下的橱窗，有一种落寞的温暖。、街灯下的橱窗，有一种落寞的温暖。14、我想未来的、我想未来的 某一天某一天 穿最美的婚纱穿最美的婚纱 嫁最爱的你嫁最爱的你15、听说每一个爱向日葵的人，都能带给人温暖、听

7、说每一个爱向日葵的人，都能带给人温暖，因为他们心底住着太阳。，因为他们心底住着太阳。16、看天空的云、看天空的云，堆在了一起。看躺在地上的你，微笑的脸庞。，堆在了一起。看躺在地上的你，微笑的脸庞。17、我想当个歌颂者，在温阳柔风中轻吟着。、我想当个歌颂者，在温阳柔风中轻吟着。18、 和你牵手的那一刻和你牵手的那一刻 ，嘈杂的世界顿时安，嘈杂的世界顿时安静，仿佛只有你我静，仿佛只有你我19、心底最柔软的阳光、心底最柔软的阳光、来自于你孩子般的模样、来自于你孩子般的模样20、我会带着你们、我会带着你们的晚安把梦做到最美的晚安把梦做到最美21、纸钱折成的花在火、纸钱折成的花在火焰下格焰下格第9页/共

8、62页其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶第10页/共62页第11页/共62页5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5+Aha Dra 5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5第12页/共62页GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+Kpn I5-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I5-3-3-55-3-3-55-3-3-5第13页/共62页GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5-3-3-5Mbo BamH Bgl5-3-3-55-A3-TT-3A-5第

9、14页/共62页第15页/共62页微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces

10、albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho第16页/共62页第17页/共62页第18页/共62页第19页/共62页* T* T* T* TM g2 +D N a s e I5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 d A T P ,d C T P ,d G T P -3 2P d T T PE . c o li D N A P O L I第20页/共62页 KlenowKlenow片段（片段（DNA pol.DNA pol.大片断）大片断）第21页/共62页聚合酶Klenow DNA -32PdNTP

11、双链DNA粘端5-外切酶变性+5335353533555533标记探针标记末端 在在cDNAcDNA克隆中，克隆中， 用于第二股链用于第二股链 的合成；的合成； DNA DNA序列分析。序列分析。第22页/共62页（PCRPCR）。）。第23页/共62页第24页/共62页第25页/共62页 DNADNA连接酶可以连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的催化带有粘性末端或平头末端的双链双链DNADNA中一条链的中一条链的3 3OHOH与另一条链的与另一条链的5 5POPO3 3H H2 2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNADNA长长链。链。 D

12、NADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1） 两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来 5 5- ACG AATTCGT-3- ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5 5-ACGAATTCGT-3-ACGAATTCGT-3 3 3- TGCTTAA GCA-5- TGCTTAA GCA-5 3 3-TGCTTAAGCA-5-TGCTTAAGCA-5（2 2） 修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接酶连接酶第26页/共62页第27页/共62页作用作用 将标记或未标记的将标记或未标记的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的

13、3 3OHOH末端；也可催末端；也可催化载体分子或待克隆的化载体分子或待克隆的DNADNA片断上加上互补的同聚尾，便于进片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接第28页/共62页工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成

14、磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNA DNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚体尾端合成同聚体尾第29页/共62页第30页/共62页第31页/共62页第32页/共62页第33页/共62页选选3. 3. 具有多克隆位点具有多克隆位点第34页/共62页广泛应用的质粒：广泛应用的质粒： pBR32质粒、质粒、pU

15、C系列等系列等第35页/共62页第36页/共62页第37页/共62页 ( (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点： 双链线状双链线状DNADNA分子，分子， 全长全长50kb50kb， 含含6565个基因，个基因， 在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为COSCOS位点。位点。第38页/共62页第39页/共62页第40页/共62页 第41页/共62页 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程第42页/共62页目的基因来源目的基因来源 1 1） 制备基因组制备基因组DNADNA 2 2） 制备制备cDNAc

16、DNA 3 3） 聚合酶链反应聚合酶链反应 4 4） 人工合成基因人工合成基因TTTTAAAA质粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATT第43页/共62页 二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法第44页/共62页TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT第45页/共62页转化到宿主细胞中(如E. coli)宿主细

17、胞染色体DNA重组质粒重组质粒第46页/共62页重组重组DNADNA导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型转化转化 以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染转染 以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导转导 以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 第47页/共62页筛选含有重组质粒的菌株宿主细胞染色体DNA重组质粒含有外源DNA的“工程菌” 四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组（筛选含重组DNA的阳性克隆）的阳

18、性克隆）第48页/共62页筛选一般有下列几种方法：筛选一般有下列几种方法： 1 平板筛选平板筛选 2 限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体筛选重组体 4 原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝白筛选蓝白筛选第49页/共62页1 平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 1） 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。第50页/共62页 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）第51页/共62页2 2）蓝蓝- -白斑白斑筛选筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，

19、筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码含有编码-半乳糖苷酶的基因。半乳糖苷酶的基因。 载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 互补互补细菌表达：细菌表达： -半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行互补进行互补产生产生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 第52页/共62页 蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图第53页/共62页第54页/共62页3. PCR3. PCR筛选重组体筛选重组体 抽提少量重组抽提少量重组DNADNAPCRPCR扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。4. 4. 原位杂交原位杂交第55页/共62页第56页/共62页含有外源DNA的“工程菌”繁殖/扩增表达产物分离纯化第57页/共62页第58页/共