8DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白ppt课件

1、综合实验（一）综合实验（一）血清蛋白质的纯化与鉴定血清蛋白质的纯化与鉴定蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 材料的选择；材料的选择； 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 蛋白质初步提纯；蛋白质初步提纯； 选择一种或几种合适的方法除

2、去杂蛋白选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；直至完全纯化； 目标蛋白的鉴定。目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 较低温度下较低温度下(04)操作，注意使用蛋白酶操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。实验目的实验目的分离血清得到高纯度的白蛋白分离血清得到高纯度的白蛋白对纯化得到的白蛋白进行电泳鉴定对纯化得到的白蛋白进行电泳鉴定实验内容实验内容第一部分：第一部分： （本周）（本周）

3、采用采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白 第二部分：第二部分： （下周）（下周） 采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化得到的白蛋白采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化得到的白蛋白第一部分第一部分DEAE-纤维素离子交换层析（纤维素离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）纯）纯化血清白蛋白化血清白蛋白本次实验目的本次实验目的1、分离血清得到高纯度的白蛋白、分离血清得到高纯度的白蛋白2、掌握、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与实验操作技术纤维素离子交换层析原理与实验操作技术3、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位

4、槽的原理与使用、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法方法根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。离子交换层析离子交换层析的基本原理的基本原理离子交换剂离子交换剂 离子交换剂由离子交换剂由（或称功能基团）（或称功能基团）和和 组成。基质一般是不溶性聚合物，如组成。基质一般是不溶性聚合物，如 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子 阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂离子交换剂离子交换剂 DEAE- cellulose(diethylaminoethyl cellulose)CM- cellulose(Carb

5、oxymethyl cellulose)离子交换剂的选择离子交换剂的选择考虑因素：考虑因素： 1. 1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷 2. 2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3. 3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境 4. 4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质 5. 5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量cationzwitterionanion+H+H+RCHCOOH|NH3+RCHCOO-|NH3+RCHCOO-|NH2-H+-H+A+A0A-pHpI起始缓冲液的选择

6、起始缓冲液的选择原则：原则： 不能与样品发生化学反应，避免使样品变性。不能与样品发生化学反应，避免使样品变性。 其其pH值和离子强度等能值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合。能使样品中杂质与离子交换剂结合。洗脱液洗脱液 指一定离子强度与一定指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液值的缓冲溶液 洗脱方法：洗脱方法： 改变洗脱液的离子强度改变洗脱液的离子强度增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 改变洗脱液的改变洗脱液的pHpH降低待分离物与离子交换剂的结合力降低待分离物与离子交换剂的结合力洗脱

7、方式：洗脱方式： 阶段洗脱法阶段洗脱法 梯度洗脱法梯度洗脱法人血浆蛋白质的等电点及分子量人血浆蛋白质的等电点及分子量 蛋白质蛋白质等电点等电点分子量分子量清蛋白清蛋白4.88690001 1- -球蛋白球蛋白5.062000002 2- -球蛋白球蛋白5.06300000-球蛋白球蛋白5.12 9000-150000-球蛋白球蛋白6.85-7.50156000-300000 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（缓冲液（pH 6.5）实验原理实验原理采用采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。血清样品用血清样品用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（醋酸铵缓

8、冲液（pH 6.5）稀释）稀释5倍后上柱。在此倍后上柱。在此pH与离子强与离子强度时，度时，DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI 4.9）。）。带正电荷蛋白质如带正电荷蛋白质如-球蛋白（球蛋白（pI约约7.3），不被吸附故直接流出。用），不被吸附故直接流出。用0.06mol/L醋醋酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量-球蛋白及球蛋白及-球蛋白。球蛋白。将醋酸铵浓度提高至将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量-球蛋白）。球蛋

9、白）。整个层析过程用整个层析过程用紫外检测仪紫外检测仪监测流出蛋白组分，用监测流出蛋白组分，用自动部分收集器自动部分收集器收集，用收集，用记记录仪录仪记录整个洗脱过程。记录整个洗脱过程。 材料与试剂材料与试剂1、主要材料、主要材料pH计、层析柱（计、层析柱（1.620cm）、固定架、聚乙烯管（不同规格）、）、固定架、聚乙烯管（不同规格）、HD-3紫紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽等。外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽等。2、主要试剂、主要试剂 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（缓冲液（pH 6.5）0.3mol/L NH4Ac缓冲液（缓冲液（pH 6.5）1.5mo

10、l/L NaCl0.3mol/L NH4Ac缓冲液（缓冲液（pH 6.5）3、样品：血清、样品：血清实验步骤实验步骤DEAE纤维素层析柱的准备纤维素层析柱的准备 （1）酸碱处理：）酸碱处理：DEAE-纤维素可按纤维素可按0.5mol/L NaOH 0.5mol/L HCl 0.5mol/L NaOH（碱（碱酸酸碱）程序处理。碱）程序处理。（2）装柱：选用短而粗的层析柱（）装柱：选用短而粗的层析柱（1.6cm20cm。将经上述酸碱处理的纤维素用。将经上述酸碱处理的纤维素用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（缓冲液（pH 6.5）浸泡后装柱，柱床体积约）浸泡后装柱，柱床体积约1.6cm6cm。装柱

11、时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表面要平整。装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表面要平整。（3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/L NH4Ac （pH 6.5）洗涤平衡，流）洗涤平衡，流速速 1ml/min。 2、DEAE纤维素层析纯化白蛋白纤维素层析纯化白蛋白1）上样：将）上样：将4ml 用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡好的层析柱表面，用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用使样品进入柱床内。小心用4ml 0.06mol/L NH4Ac缓冲液缓冲液洗涤沾在管壁上的蛋白洗涤沾在管壁上

12、的蛋白质样品，使其进入床内。质样品，使其进入床内。2）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用0.06mol/LNH4Ac缓冲液（缓冲液（pH6.5）洗）洗脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱中的缓冲液面降至与柱床表面平齐。中的缓冲液面降至与柱床表面平齐。3）白蛋白的纯化：改用）白蛋白的纯化：改用0.3mol/LNH4Ac缓冲液（缓冲液（pH6.5）洗脱。每管）洗脱。每管1ml分部收分部收集集 (调节部分收集器时间为调节部分收集器时间为1min/tube)。合并蛋白

13、质浓度高的。合并蛋白质浓度高的2-3管，用于后续蛋管，用于后续蛋白质纯度鉴定。白质纯度鉴定。 由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，收集的蛋白质为肉眼可见由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，收集的蛋白质为肉眼可见的浅黄色液体。的浅黄色液体。4）再生平衡：改用）再生平衡：改用 1.5mol/LNaCl0.3mol/LNH4Ac缓冲液洗脱，至记录仪基线缓冲液洗脱，至记录仪基线基本恢复到原始位置后，再用基本恢复到原始位置后，再用40ml 0.06mol/LNH4Ac（pH 6.5）洗脱平衡即可。）洗脱平衡即可。Sample diagram of a gel filtration sys

14、tem with gravity feed. The safety loop is designed to keep the column from running dry if left unattended. Safety loopBSZ-100自动部份收集器结构与使用方法自动部份收集器结构与使用方法 按按“复位复位”键，仪器自动复位至起点后键，仪器自动复位至起点后“报警报警”，再按，再按“复位复位”键，仪键，仪器自动复位。器自动复位。设置定时时间：设置定时时间：（1）按下）按下“手动手动/自动自动”键，使仪器处于键，使仪器处于“手动手动”状态。状态。（2）按）按“选择选择”键，设定时间为

15、键，设定时间为1min。自动收集自动收集按按“手动自动手动自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态。键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态。HD-3紫外检测仪使用方法紫外检测仪使用方法 将波长旋钮旋到将波长旋钮旋到280nm. 按下按下 “电源电源”开关。开关。调节调节“灵敏度灵敏度”旋钮至旋钮至“100”档，调节档，调节“光量光量”旋钮，使检测仪数字显示旋钮，使检测仪数字显示50左右进行仪器预热。左右进行仪器预热。开启高位槽，使层析柱缓冲液流过检测仪。在开启高位槽，使层析柱缓冲液流过检测仪。在“灵敏度灵敏度”旋钮处于旋钮处于“100”档时，调节档时，调节“光量光量”旋钮，使检测仪数字显示为旋钮，

16、使检测仪数字显示为100，即透光率为，即透光率为100。把把“灵敏度灵敏度”旋到所需档（旋到所需档（1A），调节），调节“调零调零”旋钮，使检测仪数字显示为旋钮，使检测仪数字显示为“0”。在样品检测过程中，不可再调节在样品检测过程中，不可再调节“调零调零”、“光量光量”旋钮。如绘出的图谱即出旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变峰过小，可改变“灵敏度灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。选择档，每档成两倍放大关系。 LM17型记录仪使用说明型记录仪使用说明 1.打开电源开关。打开电源开关。2.调节零位：按调节零位：按“量程量程/零位零位”切换按键，当切换按键，当“零位零位”指示灯亮时，数码管显示为

17、指示灯亮时，数码管显示为“Po” 。在零位调节状态下，按下在零位调节状态下，按下“左移左移”或或“右移右移”按键不放，使记录笔移至所需的零位。按键不放，使记录笔移至所需的零位。3.选择量程：按选择量程：按“量程量程/零位零位”切换按键，当切换按键，当“量程量程”指示灯亮时，表示当前操作为量程指示灯亮时，表示当前操作为量程选择，按选择，按增加增加或或减少减少键，选取合适的量程（键，选取合适的量程（HD-3紫外检测仪的量程为紫外检测仪的量程为10mV）。）。4.取下记录笔的塑料笔套，压下取下记录笔的塑料笔套，压下“抬抬/落笔手柄落笔手柄”（不要强力按压笔尖，以避免笔尖损坏（不要强力按压笔尖，以避免

18、笔尖损坏或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。 5.选择走纸速度：按选择走纸速度：按“启启/停停”切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，此时按切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，此时按“调速调速”键键调节选择走纸的速度。每按一下，数字依次在调节选择走纸的速度。每按一下，数字依次在0.1mm/min至至600mm/min之间变化。调之间变化。调节走纸速度为节走纸速度为2mm/min，按，按“启启/停停”键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。不记键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。不记录时按录时按“启启/停停”键，数码管闪烁，表示停止走纸。键，数码管闪烁，表示停止走纸。量程/零位 切 换键量 程显示减少/左 移键增加/右 移键状 态指 示灯电 源指 示灯盒 式纤 维笔纸 速显示调速启停抬 落笔 手柄电源开关走 纸手轮记录紫外检测仪所显示的峰值，在洗脱曲线上标示出所更换的溶液、峰记录紫外检测仪所显示的峰值，