酚氯仿法提取DNA试验报告

1、酚氯仿法和试剂盒法提取 DNA实验报告一、实验目的实验原理：酚氯仿法：先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K消化，通过酚、氯仿的抽提，使DNA进入水相与蛋白 质成分分开，在RNase#用下，降解RNA以纯化 DNA。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在 下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体 系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白 与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸晶使DNA分子完整地分离出来。 氯仿-异戊酿落 液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出 来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使 DNA析 出。氯仿异

2、戊酿抽提和乙醇沉淀方法在 DNA纯化 研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶 氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层异戊酿有助于消除抽提过程中产生的气泡。而DNA不落于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙 酿沉淀来纯化和浓缩DNA二、实验用品 试剂:1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA (pH8.0), 5M NaClTES (15mM Tris, 15mM EDTA , 15mM NaCl)Tris 饱和酚(PH8.0)氯仿/异戊酿(V/V=24/1 )10% SDS5mg/ml Protease K70%乙醇、无水乙醇TE 缓冲液(pH8.0): 10mM

3、Tris-Cl (PH8.0)1mM EDTA(PH8.0)10mg/mL漠化乙锭(EB)耗材：仪器：低温离心机、移液枪一套，低温冰箱，恒温水浴锅、紫外分光光度计(Eppendorf)。三、实验步骤4.1取血样：实验人员相互取血样 5ml.(用品：采血管、采 血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸)4.2血液样品的预处理：分取 2ml血样加入到离心管 A中 用于酚氯仿法提取 DNA。1) 破除RBC:用移液器将采血管中剩余的 3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎，再移入50ml离心管B中,再加入5倍体积无菌水，颠倒混匀，冰上静置十分钟，用 于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管

4、A中的红细 胞。2）离心管 A: 4 C, 3000rpm,离心10min,弃上清,留 沉淀，重复低渗、离心处理一次。3）离心管A :加入30ml生理盐水，上下轻轻混匀以重新 悬浮、洗涤 WBC沉淀，4C, 3000rpm,离心10min,弃 上清，留沉淀。转移到1 .5ml离心管中。 （注意尽可 能将上清弃净，同时不要丢失 WBC沉淀）4）用 Protease K 消化 WBC :在离心管中加入4ml TES，立即用移液器吹打，将细胞 团块吹散。加入 100%SDS 350 ul, 5mg/ml Protease K 100ul,充分 混匀，65C消化6 ho4. 2试剂盒法提取DNA1 ）

5、向离心管B加入3倍体积的Buffer RBL轻轻涡旋或 颠倒混匀，3000rpm离心10min,小心弃上清，留沉淀。2）向沉淀中加入 400ul Buffer GR ,并转移到1.5ml离心 管中，混匀；在此基础上加入 40ulProteaseK,混匀；再加 入400ul Buffer GL ,颠倒混匀，剧烈旋涡震荡一分钟。3 ）用塑料膜密封离心管管口， 放入恒温箱中70C 10min, （延长孵育时间）至溶液清亮。4）加入400ul无水乙醇，颠倒混匀，4°C, 3000rpm,离 心 1 min。5 ）将上步所得溶液加入到已装入收集管（ CollectionTube）的吸附柱（Sp

6、in Column DL ）中，8000g 离心 1min, 弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。6）向吸附柱中1加入 500ul Buffer GW 1 （使用前检查是否加入无 水乙醇），1 0 0 0 0 r p m离心1 m i n ,弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。7）向吸附柱中1加入 500ul Buffer GW 2 （使用前检查是否加入无 水乙醇），1 0 0 0 0 r p m离心1 m i n , 弃废液，将吸附柱重新放回 收集管中。8 ）再次1 0 0 0 0 r p m离心2 m i n ,弃废液，将吸附柱置于室温 数分钟，以彻底晾十。9）将吸附柱置于一个新的离心管中，向

7、吸附柱的中间部位悬空加入5OmlBufferGE, lOOOOrp m离心一分钟，收集DNA 溶液，2 0 C保存。4 . 3酚氯仿法法DNA提取1）消化6 h后的细胞悬:液中加入等体积的T r 1 s饱和酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置lOmin, 4 C, 3000rpm,离心10m2）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的T r i s饱和 酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置lOmin, 4°C, 3000rpm, 离心1 0 m i n o3）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比2 4 :1 ）,上下轻轻颠倒混匀,冰浴静置1 0 m 1 n , 4 C ,3 0 0 0 r p m ,离心1 0 m i n。4）将上层水相转移到一个小烧杯中，加入2. 5倍体积的无水乙醇， 冰上放置3 0 m 1 n ,可见网状DNA白色沉淀析出，轻旋小烧杯，网 状DNA聚集成团。5 ）用t 1 p头将DNA捞出，放