正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

1、PriCells 正常小鼠原代骨骼肌细胞培养一、实验试剂1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液：1 ×PBS （ pH 7.4 ） + 1% P/S4、染色液：0.4% Trypan Blue5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：鼠抗人及大鼠desmin 一抗，肌球蛋白（myosin）单克隆抗体二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4

2、、眼科镊和止血钳5、烧杯6、 15ml 离心管三、实验流程取肌肉于平皿，Hanks洗 3次剔除脂肪、结缔组织肌肉标本剪约 0.1cm3小块移至离心管， Hanks洗 3次静置 1min，弃去上层液及漂浮组织0.25%胰酶， 37度水浴消化 20min ，每 5min 摇动或吹打 1次生长培养基终止消化，反复吹打，依次100， 200， 400目过筛离心， 1000rmp,10min ，弃去上清重悬，计数细胞，接种密度以5 ×105个 /ml悬液加入未经 PPL 包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度， 1h转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37， 5%CO 24d 换液，以后每

3、天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hanks洗 3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3 小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hanks洗 3次，静置 1min，弃去上层液及漂浮组织3、 向上述离心管中加入 0.25%胰酶， 37度水浴消化 20min ，每 5min 摇动或吹打 1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200， 400目过筛，滤液收集后，1000r/min 离心 10min ；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL 包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞， 37度培养 1h

4、 后，转移包被瓶中，生长培养基培养， 4d 换液，以后每天换液 1 次。五、细胞鉴定1、显微鉴定：刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12h 后，细胞开始贴壁，72h 后贴壁完全，细胞逐渐延展成梭形，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合 80%以上后，开始形成肌管。2、免疫细胞化学染色 1：肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白 （desmin ），可采用鼠抗人及小鼠 desmin 一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。3、免疫细胞化学染色2：采用骨骼肌特异性的肌球蛋白（myosin）单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin 的细胞免疫化学染色，PBS 代替一抗做阴性对照。结果判定：以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。六、注意事项1、胰酶消化过程中，也可采用 15min 两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定，一般成年大小鼠采用两步消化效果好，幼鼠一步消化和两步消化差别不大。2、传代培养