RNA提取及其定量分析

1、RNARNA的提取及其的提取及其定量分析定量分析 张张 许许 2014-10-222014-10-22 主要内容 一、RNA的提取 二、逆转录体系1、实验原理2、注意事项3、实验流程 三、荧光定量PCR1.荧光定量PCR概念2.荧光定量PCR原理3.荧光定量PCR分类4.荧光定量PCR实验方法一、RNA的提取 氯化锂沉淀法氯化锂沉淀法 ：SDS 是一种去污剂，可以抑制内源RNA 酶的活性，它不但可解聚核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成SDS蛋白质复合物而沉淀。4 M LiCl可选择性沉淀RNA。 Trizol法法 ：Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍（强变性剂）配制而成

2、的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。 mRNA提取试剂盒提取试剂盒: 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。 1.实验原理1、内含二硫键，变性后会迅速重新折叠。2、不需二价阳离子激活。一、RNA的提取Structure of RNase A2.注意事项一、RNA的提取 ：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1 1、 尽量避免尽量避免源性源性RNaseRNase 污染污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。

3、实验台面 等要彻底清理。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C.实验所涉及的离心管，枪头必须为RNA专用；处理RNA的移液器专用。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2 2、抑制、抑制源性源性RNaseRNase 活性：活性： RNaseRNase 抑制剂。抑制剂。 2.注意事项一、RNA的提取 3.1匀浆化作用组织 100mg，加 1mlTRIzol匀浆（要彻底，后转至EP 管）组织匀浆量100mg 时分装1ml/每EP 管将匀浆样品在1530C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60- -7

4、0保存至少一个月。每510106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1107 细菌加1ml的TRIZOL ，反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态。一、RNA的提取 3 .2分离阶段剧烈摇动15S，室温2-5 分钟（30C 孵育）加氯仿1/5 体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）4，离心12000g，15 分钟混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。细胞细胞基因组基因组DNA水相有机相RNA氯仿氯仿纯化纯化pH5.7离心离心加入裂解液加入裂解液(TRNzol-A+)一、RNA的提取细胞选择细胞选择 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞一

5、、RNA的提取 3 .3 RNA的沉淀加等体积异丙醇（约400 -500l），混匀室温10 分钟转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP 管中4，离心12000g，10分钟，弃上清RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。一、RNA的提取 3.4 RNA的洗脱加冰预冷的75%乙醇（用DEPC 水配），轻弹混合样品。4离心7500g，5 分钟弃上清，空气中干燥5-10 分钟（不能完全干燥）RNA沉淀在75%乙醇中于2-8能保存至少一周，于-5- -20能保存至少一年 一、RNA的提取 3.5 RNA的再溶解溶于 DEPC 水中至20l（10l-20l）（可在55-6

6、0水中，10 分钟助溶）DEPC水中溶解的RNA于-70，或置于冰上马上进行逆转录和PCRDEPC水:是用1DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。RNA的质量检验 未降解的RNA在琼脂糖凝胶电泳后应该能看到三条带：28S rRNA；18S rRNA；由tRNA、5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊迁移较快的带，且28S的亮度应为18S两倍，且都没有弥散现象。如果孔附近还有明带，则表明产物中有DNA存在。二、RNA定量技术 优点 不足Northern 杂交1、同

7、时提供相对分子质量和丰度双方面信息2、最具美学价值耗材多、敏感性低、受RNA降解影响大核糖核酸酶保护1、比Northern杂交敏感20-100倍2、极易比较基因在不同组织中的表达不易于分析相关mRNA家族RT-PCR1、RNA纯度不必很高，仅少量模板即可满足实验所需，理论上可检验单一拷贝的RNA样品2、敏感性最高样品间扩增效率不同极大的影响信号强度（内参校正）二、逆转录1 逆转录（reverse transcription） 以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为互补DNA（complementary DNA,cDNA)。二、逆转录 R

8、NA： 1000ug/CRNA H2O： 11ul-VRNA5*First-Strand Buffer： 4ul dNTP Mix： 2ul dT: 1ul Rever tra Ace： 1ul Rnase Inhibition： 1ul TOTAL： 20ulPS: 5*First-Strand Buffer里含有氯化镁 RNA： 500ug/CRNA H2O： 5.5ul-VRNA5*First-Strand Buffer： 2ul dNTP Mix： 1ul dT: 0.5ul Rever tra Ace： 0.5ul Rnase Inhibition： 0.5ul TOTAL： 10u

9、l 2 逆转录体系二、逆转录实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 5RT Buffer在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时，请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。Rever tra Ace是油性的，加之前应混匀，加之后要涡旋dNTPs加之前混匀 。Rever tra Ace和Rnase Inhibition用之前从-30冰箱中取出，使用过程中全程放冰上，用完即放回冰箱。3 注意事项注意事项二、逆转录4 逆转录反应1、逆转录分为两步法和一步法，两步法即在一步法之前进行RNA的变性（65、5min）2、片段较长时，可适当延长延伸的时间（

10、20-60min）3、由于逆转录酶在反应后和cDNA结合，所以要在99（85）进行5min热 处理，但是如果逆转录酶添加过量，则不能进行充分热处理，所以请务必严格控制本反应逆转录酶的用量。（ 65、5min）三、荧光定量PCR1 荧光定量PCR概念 所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。2 荧光定量PCR反应原理三、荧光定量PCRX轴表示PCR循环数，Y轴表示扩增反应的荧光值基线期：荧光背景信号阶段对数期：荧光信号指数扩增阶段平台期恒定的恒定的Ct值值 所谓

11、Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。2 荧光定量PCR反应原理三、荧光定量PCR2 荧光定量PCR反应原理三、荧光定量PCR理想的PCR反应： X=X0 *2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n在扩增产物达到阈值线时: XCT =X0 (1+Ex)CT=M (1) 方程式(1)两边同时取对数得: log M=Ct*log X0(1+Ex) (2)整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M(3) Log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环 数即Ct值就可计算出样品中所含

12、的模板量n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量 Ex：扩增效率XCT:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M3.1 特异性Taqman水解探针法三、荧光定量PCR Taqman荧光探针：荧光探针：一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。 在当探针与靶序列配对进行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生.3.2 非特异性SYBR Green I染料法三、荧光定量PCR SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区

13、域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量。 3.2 非特异性SYBR Green I染料法三、荧光定量PCRSYBR Green I作用机理示意图作用机理示意图4 实验方法绝对定量绝对定量 是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。相对定量相对定量 是在相当量的试验组（样品A）和对照

14、组（样品B）中一个靶基因的相对比率三、荧光定量PCR三、荧光定量PCR4.1相对定量分析反应准备物品：引物稀释： 10倍：1ulF+1ulR+8ulddH2O 20倍：1ulF+1ulR+18ulddH2O 模板浓度：如果是首次实验,最好做浓度梯度，至少两个稀释度。 一般而言，Ct值在1530范围内比较合适。 ddH2O SYBR GREEN(避光) PCR专用八连管 枪（量程合适10ul） 枪头（进口枪头）仪器: 定量PCR仪约时间、如果第一个做提前开机预热4.2反应体系三、荧光定量PCR引物引物（上下游混合并已稀释好） 4ul 模板模板（稀释后的cDNA） 1ul Taq DNA聚合酶dNTP二价阳离子（Mg2+ 优于Mn2+ ）一价阳离子（kcl） 缓冲液SYBR Green SYBR Green mix 5ul三、荧光定量PCR1、预变性的条件适用于热态启动的PCR反应过程中耐热性DNA聚合酶抗体的失活，轻易不要改动。2、退火温度最好在55-65，取决于探针的解链温度；退火的时间一般5-20s，过长会降低效率，过短则会增加非特异性扩增3、如果使用的探针或引