SOD酶的纯度分析及活力测定-修

1、超氧化物歧化酶的活力测定超氧化物歧化酶的活力测定老老 师：师： 余子全余子全研究生：徐沙研究生：徐沙 刘雪梅刘雪梅目的：学习并掌握测定超氧化物歧化酶活力的原理目的：学习并掌握测定超氧化物歧化酶活力的原理 及方法。及方法。内容：内容：1.超氧化物歧化酶活力测定的原理。超氧化物歧化酶活力测定的原理。 2.超氧化物歧化酶的活力测定实验。超氧化物歧化酶的活力测定实验。1.材料：从黄豆中提取的SOD酶、SOD酶标准品。2.仪器：恒温水浴锅、紫外分光光度计、微量进样器、试管。3.试剂：(1)pH 8.2 50mM Tris-HCl缓冲液；(2)50mM 邻苯三酚；(3)10mM HCl。4.试剂的配置(1

2、)pH8.2 50 mM Tris-HCl缓冲液Tris 0.61gEDTA 0.037g加双蒸水约80ml，充分溶解后，用HCl调pH至8.2，定容至100ml。(2)50mM 邻苯三酚邻苯三酚 0.063g用10mM HCl溶解，定容至10ml，现配先用，避光保存。(3)10mM HCl在一般情况下，在一般情况下，SOD活性测定只能应用活性测定只能应用间接活性间接活性测定法测定法。其测定其测定方法很多，常见的有方法很多，常见的有化学法化学法、免疫法、免疫法和等电点聚焦法和等电点聚焦法 ，其中化学法应用最普遍其中化学法应用最普遍。化学法的化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有

3、原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和色中间物和O2 -，利用，利用SOD分解而间接推算酶活力。分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，还原法，光化学扩增法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自邻苯三酚自氧化方法氧化方法。邻苯三酚简介邻苯三酚简介 邻苯三酚又名焦性没食子邻苯三酚又名焦性没食子酸，白色有光泽结

4、晶体，加热酸，白色有光泽结晶体，加热时易升华，需避光保存。在露时易升华，需避光保存。在露光的空气中会逐渐变成淡灰光的空气中会逐渐变成淡灰色，水溶液在空气中逐渐变色，水溶液在空气中逐渐变暗，在碱性溶液中迅速变暗暗，在碱性溶液中迅速变暗 ，易溶于水、醇、醚，微溶于易溶于水、醇、醚，微溶于苯、氯仿、二硫化碳。对皮苯、氯仿、二硫化碳。对皮肤、粘膜的刺激性极强。作为化学试剂，主要用作肤、粘膜的刺激性极强。作为化学试剂，主要用作作还原剂。作还原剂。 邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法原理原理：邻苯三酚在酸性环境中较稳定，但在碱性条件邻苯三酚在酸性环境中较稳定，但在碱性条件下，能迅速自氧化，自氧化过程中只接受

5、一个电下，能迅速自氧化，自氧化过程中只接受一个电子生成子生成O2 - (超氧阴离子自由基超氧阴离子自由基)，同时生成颜色中，同时生成颜色中间产物间产物(红桔酚红桔酚)，反应开始后反应液先变成黄绿色，反应开始后反应液先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在几分钟后转为黄色，线性时间维持在34分钟。分钟。邻邻苯三酚的自氧化速率与生成的苯三酚的自氧化速率与生成的O2 -的浓度呈正相关，的浓度呈正相关，故可以通过紫外可见分光光度计来定量测定抗氧故可以通过紫外可见分光光度计来定量测定抗氧化剂在此体系中对化剂在此体系中对O2 -的清除作用，间接评价抗氧的清除作用，间接评价抗氧化剂的抗氧化能力。化剂的

6、抗氧化能力。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶初始阶段段，中间物的积累在滞留，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成后，与时间成线性线性关系关系，一般线性时间维持在，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物的范围内，中间物在在325nm波长处有强烈光吸收。当有波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，存在时，由于它能催化由于它能催化O2 -与与H+结合生成结合生成O2和和H2O2，从而阻，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下的光吸收变化速率计算通过测定它们在特定波长

7、下的光吸收变化速率计算出出SOD的酶活性的酶活性 。 邻苯三酚邻苯三酚 O2 - + 红桔酚红桔酚 (自氧化：有色物质积累，吸光值增加自氧化：有色物质积累，吸光值增加) O2 - + O2 - + 2H+ H2O2+ O2(SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低催化：阻止中间产物积累，吸光值降低) pH=8.2SOD 3.2 SOD酶活力计算：酶活力计算： 酶活力单位定义酶活力单位定义:在一定条件下在一定条件下,每每1ml反应液中每分钟抑反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量定义为一个活力时的酶量定义为一个活力单位。单位。 邻苯三酚的自氧化曲线邻苯三酚的自氧化曲线(25 pH8.2Tris-HCl缓冲液缓冲液4.5mL 45mL邻苯三酚溶液邻苯三酚溶液0.01mL)BackSOD酶对邻苯三酚自氧化的抑制酶对邻苯三酚自氧化的抑制 酶活力测定曲线酶活力测定曲线Back注意事项：注意事项：1.加入邻苯三酚后，后续操作要迅速，最好能在加入邻苯三酚后，后续操作要迅速，最好能在30s45s之内完成。之内完成。2.邻