理论课21第二十一章 免疫学检测原理

1、1 第二十一章第二十一章 免疫学检测原理免疫学检测原理第一节第一节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离和纯化一、免疫细胞的分离和纯化 二、淋巴细胞及亚群的检测二、淋巴细胞及亚群的检测 三、免疫细胞的功能测定三、免疫细胞的功能测定第二节第二节 免疫分子的检测免疫分子的检测 一、免疫球蛋白的测定一、免疫球蛋白的测定 二、补体测定二、补体测定 三、细胞因子及其受体的检测三、细胞因子及其受体的检测 四、黏附分子的检测四、黏附分子的检测第三节第三节 免疫学检测常用的标记技术免疫学检测常用的标记技术 一、免疫荧光技术一、免疫荧光技术 二、放射免疫测定二、放射免疫测定 三、免疫酶标技术三、免疫

2、酶标技术2 免疫学检测技术：包括细胞、分子、相关基因三个水平免疫学检测技术：包括细胞、分子、相关基因三个水平 细胞水平检测：根据免疫细胞膜表面表达的独特标志及特殊细胞水平检测：根据免疫细胞膜表面表达的独特标志及特殊功能，测定各类细胞及其亚群数量及效应，籍以了解细胞免疫功能，测定各类细胞及其亚群数量及效应，籍以了解细胞免疫水平水平 分子水平检测：测定各类分子水平检测：测定各类Ig、补体、补体、CK及受体、黏附分子水及受体、黏附分子水平及生物学活性，籍以了解各类免疫因子间的相互关系平及生物学活性，籍以了解各类免疫因子间的相互关系 基因水平检测：测定免疫应答相关基因的表达与调控，免疫基因水平检测：测

3、定免疫应答相关基因的表达与调控，免疫分子的遗传多态性及基因型别分析分子的遗传多态性及基因型别分析3 第一节第一节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测 一、免疫细胞的分离和纯化一、免疫细胞的分离和纯化 依据细胞独特的表面标志、理化性质及黏附吞噬能力等差异依据细胞独特的表面标志、理化性质及黏附吞噬能力等差异设计不同方法，按不同实验目的、拟分离细胞的种类、纯度和数设计不同方法，按不同实验目的、拟分离细胞的种类、纯度和数量等，选择方法量等，选择方法（一）白细胞的分离（一）白细胞的分离 根据红、白细胞比重、沉降速度不同分离根据红、白细胞比重、沉降速度不同分离1、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，红细胞沉降速度快

4、，自、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，红细胞沉降速度快，自 然分离然分离2、高分子聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、高分子聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮可使红细胞成钱串状凝集，加速沉降聚乙烯吡咯烷酮可使红细胞成钱串状凝集，加速沉降4（二）外周血单个核细胞（二）外周血单个核细胞（PBMC）的分离）的分离 PBMC包括淋巴细胞和单核细胞，人包括淋巴细胞和单核细胞，人PBMC来源于外周血，来源于外周血，动物大、小鼠单个核细胞来源于脾脏、淋巴结（动物大、小鼠单个核细胞来源于脾脏、淋巴结（MNC）。）。 标本：人肝素防凝外周血；鼠脾脏、淋巴结标本：人肝素防凝外

5、周血；鼠脾脏、淋巴结,机械研磨机械研磨过过100目网目网单个细胞悬液。单个细胞悬液。 密度梯度离心法：红细胞和多核细胞密度为密度梯度离心法：红细胞和多核细胞密度为1. 092，PBMC为为 1.075-1.090，血小板为，血小板为1.030-1.035； 聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺（泛影葡胺（F-H）分层液法：）分层液法： 原理：原理： F-H分层液密度为分层液密度为1.077，将，将PBMC层加于分层液上层加于分层液上离离 心心不同层次液体和细胞区带不同层次液体和细胞区带5（三）淋巴细胞的纯化与亚群分离（三）淋巴细胞的纯化与亚群分离1、去除红细胞：低渗溶解；、去除红细胞：低渗溶解；0.89%氯

6、化铵处理法氯化铵处理法2、去除单核、粒细胞：、去除单核、粒细胞： PBMC 玻璃、塑料平皿黏附去除玻璃、塑料平皿黏附去除3、尼龙毛柱分离法：、尼龙毛柱分离法： B细胞易黏附尼龙毛，过尼龙毛柱可分离细胞易黏附尼龙毛，过尼龙毛柱可分离 T、B细胞细胞4、流式细胞术分选法：基本原理：流式细胞仪可快速、灵敏和、流式细胞术分选法：基本原理：流式细胞仪可快速、灵敏和 高度自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而分选高度自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而分选 特异性荧光抗体标记的阳性细胞特异性荧光抗体标记的阳性细胞（四）单核（四）单核/巨噬细胞的分离和收集巨噬细胞的分离和收集1、平皿黏附分

7、离法、平皿黏附分离法2、斑蝥敷贴法：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷前臂内侧皮肤，、斑蝥敷贴法：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷前臂内侧皮肤， 诱发无菌皮炎，收集皮泡渗出液中来自皮下组织的诱发无菌皮炎，收集皮泡渗出液中来自皮下组织的3、硫基乙醇酸盐肉汤培养基、硫基乙醇酸盐肉汤培养基小鼠腹腔小鼠腹腔收集腹腔渗出收集腹腔渗出6二、淋巴细胞及亚群的检测二、淋巴细胞及亚群的检测 根据细胞表面标志鉴定淋巴细胞亚群及检测计数根据细胞表面标志鉴定淋巴细胞亚群及检测计数1、T细胞检测细胞检测1）间接免疫荧光法：原理：抗）间接免疫荧光法：原理：抗CD抗体与抗体与PBMC结合结合加入荧光加入荧光 素标记的羊素标记的羊/兔抗小

8、鼠兔抗小鼠IgG抗体抗体(荧光标记二抗荧光标记二抗)荧光显微镜计数荧光显微镜计数2）免疫组织化学法：原理：酶标记抗体与组织切片或细胞涂片）免疫组织化学法：原理：酶标记抗体与组织切片或细胞涂片 反应反应, 结合结合加入底物加入底物酶催化底物显色酶催化底物显色普通光学显微镜检测普通光学显微镜检测 表面标志表面标志鉴定细胞种类、亚群鉴定细胞种类、亚群2、B细胞检测细胞检测1）膜表面免疫球蛋白（）膜表面免疫球蛋白（SmIg）检测：应用抗）检测：应用抗Ig抗体借助直接免抗体借助直接免 疫荧光法或免疫组织化学法检测疫荧光法或免疫组织化学法检测2）间接免疫荧光法）间接免疫荧光法, 同同T细胞细胞7三、免疫细

9、胞的功能测定三、免疫细胞的功能测定（一）吞噬细胞功能测定：（一）吞噬细胞功能测定：1、中性粒细胞趋化功能测定、中性粒细胞趋化功能测定 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden小室法）：上室加待测细胞，下室加趋小室法）：上室加待测细胞，下室加趋 化成分，中间用微孔滤膜隔开化成分，中间用微孔滤膜隔开反应反应滤膜清洗、固定、染色滤膜清洗、固定、染色 透明透明普通光学显微镜观察细胞穿膜移动距离普通光学显微镜观察细胞穿膜移动距离判断趋化功能判断趋化功能2、中性粒细胞吞噬杀菌功能测定、中性粒细胞吞噬杀菌功能测定 NBT（硝基蓝四氮唑还原）试验：原理：中性粒细胞吞噬杀（硝基蓝四氮唑还原）试验：原理：中性粒细胞吞

10、噬杀 菌代谢菌代谢释放氢释放氢摄入的摄入的NBT接受接受胞浆沉积黑色颗粒胞浆沉积黑色颗粒 10% NBT+83、巨噬细胞吞噬功能测定：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷法收、巨噬细胞吞噬功能测定：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷法收 集人集人 ，用腹腔渗出法，用腹腔渗出法收集鼠收集鼠 ，体外进行鸡红细胞，体外进行鸡红细胞(有胞有胞 核核)吞噬实验，计算吞噬百分率、吞噬指数吞噬实验，计算吞噬百分率、吞噬指数4、巨噬细胞细胞毒测定：测定、巨噬细胞细胞毒测定：测定 对对放射性核素放射性核素51Cr、 125IUdR 标记靶细胞标记靶细胞P815的杀伤活性的杀伤活性 51Cr标记靶细胞：标记靶细胞：51Cr渗透入细

11、胞浆渗透入细胞浆，细胞破坏细胞破坏释放释放51Cr 于上清中于上清中 125IUdR标记标记靶细胞：靶细胞： 125IUdR掺入掺入细胞细胞DNA，细胞破坏，细胞破坏 酶切酶切DNA 释放释放 125I 于细胞沉淀中于细胞沉淀中 将效将效/靶按一定比例混合靶按一定比例混合效效/靶相互作用靶相互作用靶细胞破坏靶细胞破坏释释 放放核素核素测定上清测定上清/细胞沉淀放射性强度（细胞沉淀放射性强度（cpm）按公式计算按公式计算 杀伤百分率杀伤百分率9（二）（二）T细胞功能测定细胞功能测定1、 T细胞增生（转化）实验：原理：细胞增生（转化）实验：原理： T细胞受到丝裂原刺激细胞受到丝裂原刺激 增生反应增

12、生反应形态变化形态变化淋巴母细胞：体积大，染色质疏松，核淋巴母细胞：体积大，染色质疏松，核 仁明显等仁明显等 丝裂原：丝裂原：PHA、ConA（鼠）、（鼠）、PWM等等1）放射性核素（）放射性核素（ 3HTdR、125IUdR）掺入法：原理）掺入法：原理: 细胞增生细胞增生 摄取摄取 3HTdR/125IUdR 测放射性强度测放射性强度计算转化率、刺激指数计算转化率、刺激指数2）细胞能量代谢测定（）细胞能量代谢测定（MTT 四氮唑盐比色法）四氮唑盐比色法） ：原理：活细：原理：活细 胞摄入胞摄入MTT 腺粒体作用腺粒体作用胞内、胞周蓝黑色甲臜胞内、胞周蓝黑色甲臜溶解甲臜溶解甲臜 酶标仪检测酶标

13、仪检测A值，计算转化率、刺激指数。甲臜生成量与细胞值，计算转化率、刺激指数。甲臜生成量与细胞代谢活跃程度呈正比，间接定量分析细胞增生水平代谢活跃程度呈正比，间接定量分析细胞增生水平102、T细胞细胞介导的细胞毒实验细胞细胞介导的细胞毒实验 原理原理 CTL来源：免疫动物的脾脏或腹腔渗出液；将脾细胞与刺激来源：免疫动物的脾脏或腹腔渗出液；将脾细胞与刺激 细胞共育，体外诱生细胞共育，体外诱生CTL刺激细胞：预处理后无增殖能力，仍保持免疫源性的细胞刺激细胞：预处理后无增殖能力，仍保持免疫源性的细胞检测检测CTL细胞毒活性：形态学法；细胞毒活性：形态学法；51Cr、125IUdR释放法；流释放法；流

14、式细胞术等。靶细胞为免疫用细胞式细胞术等。靶细胞为免疫用细胞/不处理的刺激细胞不处理的刺激细胞 51Cr、125IUdR释放法释放法: 效效/靶按一定比例混合靶按一定比例混合效效/靶相互作用靶相互作用靶细胞破坏靶细胞破坏释释 放放核素核素测定上清测定上清/细胞沉淀放射性强度（细胞沉淀放射性强度（cpm）按公式计算按公式计算 杀伤百分率杀伤百分率113、T细胞功能的体内检测法细胞功能的体内检测法 接触性超敏反应：用于研究免疫调节药物对细胞免疫的影响接触性超敏反应：用于研究免疫调节药物对细胞免疫的影响 某些半抗原某些半抗原涂小鼠皮肤涂小鼠皮肤致敏致敏再次接触再次接触半抗原半抗原活化的活化的 CD4

15、+T CK 接触性皮炎接触性皮炎12（三）（三）B细胞功能测定细胞功能测定1、B细胞增生实验：方法原理与细胞增生实验：方法原理与T细胞同，但丝裂原为细胞同，但丝裂原为PWM， LPS（鼠），（鼠），SPA金葡菌，抗金葡菌，抗IgM抗体等抗体等2、溶血空斑形成实验：原理：、溶血空斑形成实验：原理：SRBC免疫小鼠免疫小鼠取脾取脾制成单制成单 个细胞个细胞与与SRBC在琼脂糖凝胶中混合在琼脂糖凝胶中混合 注入平皿或玻片注入平皿或玻片脾脾 细胞中抗体生成细胞释放抗细胞中抗体生成细胞释放抗SRBC抗体（溶血素）抗体（溶血素） 与周围与周围 SRBC结合结合加入补体加入补体抗体生成细胞周围溶血抗体生成细

16、胞周围溶血肉眼可见的肉眼可见的 溶血空斑，每空斑代表溶血空斑，每空斑代表1个抗体生成细胞个抗体生成细胞空斑计数空斑计数3、酶联免疫斑点法（、酶联免疫斑点法（ELISPOT）：原理：已知抗原包被于固）：原理：已知抗原包被于固 相载体相载体加入待测抗体生成细胞加入待测抗体生成细胞释放特异性抗体结合抗原释放特异性抗体结合抗原 抗体生成细胞结合于固相载体抗体生成细胞结合于固相载体加入酶联二抗加入酶联二抗与结合于固相与结合于固相 载体的细胞上抗体结合载体的细胞上抗体结合加底物显色反应加底物显色反应着色的斑点形成细着色的斑点形成细 胞胞镜检计数斑点（计算机软件计算、统计）镜检计数斑点（计算机软件计算、统计

17、）13（四）（四）NK细胞活性测定：细胞活性测定： 靶细胞：人靶细胞：人K562； 鼠鼠YAC-11、放射性核素、放射性核素释放法：释放法： 51Cr、125IUdR标记标记靶细胞靶细胞效效/靶相靶相 互作用互作用靶细胞破坏靶细胞破坏释放释放核素核素测定上清测定上清/细胞沉淀放射性细胞沉淀放射性 强度（强度（cpm）公式计算公式计算NK杀伤百分率杀伤百分率2、酶释放法：原理：效、酶释放法：原理：效/靶相互作用靶相互作用靶细胞破坏靶细胞破坏释放乳酸释放乳酸 脱氢酶（脱氢酶（LDH）加底物显色加底物显色取上清比色测取上清比色测LDH A值（光值（光 密度值）密度值）公式计算公式计算NK杀伤百分率杀

18、伤百分率3、流式细胞术：、流式细胞术：原理：碘化丙叮（原理：碘化丙叮（PI）与死亡靶细胞）与死亡靶细胞DNA/RNA 结合结合激发荧光激发荧光流式细胞仪检测流式细胞仪检测靶细胞死亡率靶细胞死亡率14 第二节第二节 免疫分子的检测免疫分子的检测一、免疫球蛋白的测定一、免疫球蛋白的测定 常用方法：常用方法： 单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法 免疫化学自动分析仪测定免疫化学自动分析仪测定二、补体测定二、补体测定 血清总补体活性测定血清总补体活性测定 CH50 原理：应用兔抗原理：应用兔抗SRBC抗体抗体-SRBC 免疫复合物免疫复合物 激活待测激活

19、待测血清中补体经典途径血清中补体经典途径 SRBC 溶血溶血 以以50% 溶血为判定结果溶血为判定结果的终点，称的终点，称CH50。诊断总补含量减少或补体成分缺失。诊断总补含量减少或补体成分缺失 15 （三）补体各种成分测定（三）补体各种成分测定 C1q、C3、B、C1INH 单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法 ELISA（酶免疫吸附检测）、（酶免疫吸附检测）、 RIA（放射免疫测定）（放射免疫测定）（四）补体裂解产物测定（四）补体裂解产物测定 C3a、C3d、C5a 免疫电泳、交叉免疫电泳、免疫电泳、交叉免疫电泳、ELISA、RIA 用于某些

20、疾病诊断和病情监测用于某些疾病诊断和病情监测（五）补体受体（五）补体受体（CR）测定）测定 酶酶荧光素荧光素胶体金标记抗胶体金标记抗CR抗体等抗体等 诊断补体受体缺陷诊断补体受体缺陷16三、细胞因子及其受体的检测三、细胞因子及其受体的检测 （一）（一） CK生物学活性检测法生物学活性检测法 原理：根据原理：根据CK特定的生物学活性，采用相应的检测系统（各特定的生物学活性，采用相应的检测系统（各种依赖性细胞株种依赖性细胞株/ 靶细胞），通过与标准品比对，判定样品中靶细胞），通过与标准品比对，判定样品中CK活性，用活性单位（活性，用活性单位（U/ml）表示）表示1、细胞增生或增生抑制法：原理：用对

21、特定、细胞增生或增生抑制法：原理：用对特定CK依赖依赖/抑制的细抑制的细 胞株与待测胞株与待测CK培养，检测细胞增生或增生抑制，与标准品比对培养，检测细胞增生或增生抑制，与标准品比对 判断活性单位。如判断活性单位。如IL-2，TGF- 。用。用 3HTdR掺入法，掺入法，MTT法法3、细胞毒活性测定：原理：、细胞毒活性测定：原理： 以结晶紫染色法、以结晶紫染色法、MTT法等测法等测TNF 对特定靶细胞（对特定靶细胞（L929、WEHI164.13）的细胞毒活性）的细胞毒活性4、细胞病变抑制法：原理：以、细胞病变抑制法：原理：以VSV-WISH（人）、（人）、 VSV-L929（鼠）系统，检测（

22、鼠）系统，检测IFN对对VSV易感细胞株的易感细胞株的50%病变抑制效应病变抑制效应 与标准品比对，判定活性单位与标准品比对，判定活性单位17（二）（二）CK免疫学检测免疫学检测 ELISA、免疫、免疫PCR、RIA、免疫印迹法、免疫印迹法（三）（三）CKR检测检测 RIA、标记的抗、标记的抗CKR单抗法；单抗法； ELISA检测检测sCKR四、黏附分子的检测四、黏附分子的检测（一）细胞表面（一）细胞表面AM检测检测 间接免疫荧光法、流式细胞术、间接免疫荧光法、流式细胞术、 ELISA、RIA法等法等（二）可溶性（二）可溶性AM检测检测 ELISA法法18 第三节第三节 免疫学检测常用的标记技

23、术免疫学检测常用的标记技术 一、免疫荧光技术一、免疫荧光技术 基本原理：以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂用基本原理：以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定（一）免疫荧光显微技术（一）免疫荧光显微技术 荧光显微镜观察荧光显微镜观察1、直接免疫荧光法：特异性抗体直接检抗原、直接免疫荧光法：特异性抗体直接检抗原检出荧光检出荧光+细胞细胞2、间接免疫荧光法：二抗标荧光、间接免疫荧光法：二抗标荧光检出荧光阳性细胞检出荧光阳性细胞（二）流式细胞术（二）流式细胞术（FCM） 流式细胞仪流式细胞仪1、分析单个细胞表面标志、

24、分析单个细胞表面标志2、分选收集不同类型细胞、分选收集不同类型细胞3、对同一细胞进行多参数如、对同一细胞进行多参数如DNA、RNA、蛋白质、细胞体积等、蛋白质、细胞体积等 信息分析信息分析19二、放射免疫测定（二、放射免疫测定（RIA） 放射性检测仪器放射性检测仪器 以放射性核素为示踪剂的免疫标记技术，将核素分析的高灵敏以放射性核素为示踪剂的免疫标记技术，将核素分析的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性相结合度和抗原抗体反应的特异性相结合（一）（一） RIA 原理：以放射性核素标记的抗原（原理：以放射性核素标记的抗原（Ag?）和待测的未和待测的未标记抗标记抗原与固定量的特异性抗体竞争结合，或进行竞争

25、抑制反应原与固定量的特异性抗体竞争结合，或进行竞争抑制反应 当当Ag?和和Ab量固定时，量固定时， Ag?-Ab形成量受形成量受Ag含量制约；含量制约； 若若Ag量高时量高时Ag-Ab , Ag?-Ab , Ag?-Ab形成量与形成量与未未标记标记Ag呈负相关呈负相关关系关系, 即放射性即放射性(cpm) 待测待测Ag含量含量 ， cpm 待测待测Ag含量含量 （二）免疫（二）免疫放射测定（放射测定（IRMA） 原理：将待测原理：将待测Ag与过量与过量Ab?反应反应 Ag-Ab? 加入固相加入固相Ag Ag-Ab? 和固相和固相Ag-Ab 离心沉淀去除固相离心沉淀去除固相Ag-Ab 检测上清检

26、测上清Ag-Ab? cpm推算待测推算待测Ag含量含量20三、免疫酶标技术三、免疫酶标技术 基本原理：以酶标抗体基本原理：以酶标抗体/抗原与细胞抗原与细胞/组织中抗原组织中抗原/抗体结合，通抗体结合，通过相应酶底物的显色反应，对待检细胞过相应酶底物的显色反应，对待检细胞/组织中抗原组织中抗原-抗体定位、抗体定位、定性分析，亦可据显色深浅定量分析定性分析，亦可据显色深浅定量分析（一）酶免疫组织化学技术（一）酶免疫组织化学技术（EIH） 通过底物被酶显色示踪组织中抗原通过底物被酶显色示踪组织中抗原- 抗体结合物的存在抗体结合物的存在 普通光镜、电镜观察普通光镜、电镜观察 ABC法：用生物素法：用生物素(B)标记过氧化物酶，可携带多个酶分子，标记过氧化物酶，可携带多个酶分子， 可提高酶反应敏感性。将亲和素可提高酶反应敏感性。将亲和