核酸的提纯与质量鉴定1

1、核酸的提纯与质量鉴定我们需要提取什么核酸？ DNA RNA基因组DNA质粒DNA总RNAmRNAmicroRNA我们需要做什么？样品准备核酸提取、纯化质量鉴定样品保存质粒DNA提取小量质粒DNA提取（ 10 g） 主要用于分子克隆相关操作。中等量质粒DNA提取(几十到几百 g) 主要用于细胞转染实验。含有质粒宿主菌的液体培养（LB+抗生素）菌体收集菌体裂解质粒纯化（硅胶膜、或离子交换树脂等）基本分离原理最为典型的小抽和中抽操作步骤纯化中使用的各种溶液配方注意事项LB：酵母抽提物，胰蛋白胨质量，pH一般在6.8-7.4间就行。抗生素种类，浓度培养时间37,12-16h; 个别宿主菌和质粒可能需要

2、其他温度培养。质粒拷贝数高低缓冲液P1中是否加入了RNase A离心收集菌体不要过实，造成重悬困难中抽裂解液要充分离心去除沉淀，以免堵柱子。洗涤缓冲液中是否加入建议浓度的乙醇。异丙醇沉淀出质粒干燥时要适度，不要不干，不要过干。DNA定量 Nanodrop 微量分光光度计 校零缓冲液与溶解质粒的相同。 1 OD(260nm)=50 g/ml DNA 纯度：OD(260nm)/OD(280nm)在1.6-2.0之间。 如1.6可能有蛋白质污染；2.0可能有RNA污染。电泳分析基因组DNA的提取 根据用途选择方法 PCR: 根据要扩增的片段长短和扩增难度选择提取方法。 如果建库，做基因组测序，酶切或

3、做Southern选择质量高的方法提取。 讲解实例动物细胞、组织中基因组DNA提取全血中基因组DNA提取-试剂盒法样品准备 新鲜细胞、血液、组织 低温冷冻样品（液氮或-80）n特别注意：全血最佳保存条件是4-8 ，深低温冻存前要先裂解红细胞。粗提法（500bp PCR） 硷裂解法 缓冲液配方：A:0.1M或0.2M NaOH; B:0.02M或0.04M Tris-HCl pH7.5-8; 1-10万细胞，或组织50-100g, 加入20l A 90C 30-60min, 180l B中和，2-5 l用于50l体系PCR 酶法 提取缓冲液配方：10 mM Tris pH8，2 mM EDTA，

4、0.2% Triton X-100，200 g/ml Proteinase K，RNase 50 g/ml 1-10万细胞，或组织50-100g,加入50-100l 缓冲液， 50-56C 2-3 hrs ，煮沸5-10min，冰浴冷却， 10-15 l用于50l体系PCR. 完整基因组DNA提取(以Promega Wizard Genomic DNA purification kit 为例)1红细胞的裂解2白细胞的裂解3RNA和蛋白质的去除4DNA沉淀和溶解DNA得率与材料量间的关系试剂盒组成及自备试剂自备：异丙醇和70%乙醇，用高压灭菌的Milli-Q水配制操作步骤基因组DNA的鉴定 不同

5、浓度琼脂糖分离DNA的有效范围 (kb) 0.35-60 0.61-20 0.70.8-10 0.90.5-7 1.20.4-6注意问题纯度A260/A2801.82.0长度分析:准确的要用脉冲场电泳DNA完整性不好: 反复冻融, 样品太老, 中间步骤太剧烈DNA干燥时要干但不能干过, 火候很重要RNA的提取 RNA组成： rRNA: 80-90% mRNA: 2.5-5%(including precursors of regulatory RNA) tRNA: 10-15%总RNAmRNAmicroRNA提取示例样品保存RNase的性质及对策124个残基, 13.7 kDa, pI=9.6

6、3 耐热性，180分布广泛，细菌，人体，组织细胞性质性质 对策对策1 操作区域、台面的清洁（RNaseZap Wipes等）2 用无Rnase的容器，移液器具，操作戴手套3 样品液氮深低温速冻保存 RNA later(Qiagen)室温、冷藏、冷冻都可以。4 使用灭活Rnase的水（DEPC处理后高压灭活），溶解无Rnase的药品，在提取的RNA中加入Rnase抑制剂总RNA的提取提取方法有机溶剂法：如Trizol（苯酚+异硫氰酸胍）法亲和纯化法：如膜亲和法Trizol法的基本流程贴壁细胞培养板(直接加入1ml/cm2)或50-100mg组织进行匀浆4, 12,000g离心10min室温5mi

7、n使核酸蛋白质复合物解离200ul氯仿剧烈震荡15s室温静置5min4 ,12,000g离心15min取上清加入0.5ml异丙醇12,000g离心10min沉淀中加入1ml 75%的乙醇洗涤 ，7500g离心5min室温干燥,溶解亲和柱纯化如果必要DNaseI 处理mRNA 纯化AAAAAATTTTTT常用试剂盒操作步骤的比较RNA的定量1. UV法: 1OD(260nm)unit=40 g/ml 2. 荧光法: 测定浓度比较低的RNA,如mRNA,Qbit检测试剂盒,5-100ng如果A260/2801.7,很可能有蛋白质污染如果A260/2301.7,很可能有胍的污染Degraded RN

8、ADNA28S18S5S rRNA, tRNA, and other small RNA moleculesmRNA = background smearhigh low MW 100 50 25 ngGenomic DNA markersRNA 完整性分析毛细管电泳法Agilent 2100 bioanalyzer 毛细管电泳分析RNA 完整性1%变性琼脂糖凝胶电泳分析纯化的mRNAmicroRNA的提取1.成熟miRNA的长度大多为19-24nt2.目前在总RNA基础上富集miRNA实际上是分离200nt的RNA和200nt 的RNA也是可以的。5.长度不同的RNA与硅胶膜/玻璃纤维的结合是靠乙醇的浓度来进