马棘70醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

1、马棘70%醇提取物对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响 作者：胡泽华，郜邦鹏，黄德斌【摘要】 目的探讨马棘70醇提取物（IPM）的抗动脉粥样硬化作用及机制。方法用不同浓度的马棘、肝素孵育体外培养的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 12 h后，加入氧化低密度脂蛋白（OX-LDL ）作用，用免疫组化和逆转录聚合链反应（RT-PCR）分别检测IPM对低密度脂蛋白受体（LDL-R）蛋白和mRNA表达的影响。结果马棘能明显降低小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的LDL-R蛋白和mRNA 表达，且对OX-LDL引起的LDL-R表达降低有保护作用。结论马棘具有降低巨噬细胞LDL-R的表达和逆转OX-LDL

2、的作用，这可能是其抗动脉粥样硬化的重要作用机制。 【关键词】 马棘 巨噬细胞 低密度脂蛋白Abstract：ObjectiveTo explore the antiatherogenic mechanism of alcohol extract from Indigofera pseudotinctoria Matsum (IPM). MethodsThe cell was incubated with different concentration of IPM or heparin for 12 h that was established by culturing mouse macmp

3、hage RAW264.7, then OX-LDL was added into culture plate. The experiment was terminated after OX-LDL took action for 24 h. The expressions of LDL-R protein and mRNA were determined by immunohistochemistry or RT-PCR, respectively. ResultsThe expression of LDL-R protein and mRNA in mouse macrophage RAW

4、264.7 was reduced after being incubated with OX-LDL for 24 h .IPM reinforcemented the expressions of LDL-R protein and mRNA which were reduced by OX-LDL . ConclusionOX-LDL can inhibit the expression of LDL-R protein and mRNA in macrophage. IPM can reverse this effect of OX-LDL . This may be one of a

5、ntiatherogenic mechanism.2 / 17Key words： Indigofera pseudotinctoria Matsum (IPM)； Macrophage ； Low density lipoprotein 马棘（Indigofera pseudotinctoria Matsum，IPM）为豆科木篮属植物，以根或全株入药。又名一味药、野绿豆、马料梢、山皂角、野篮枝子。性味苦、涩，平，具有清热解毒、消肿散结之功效。用于感冒咳嗽，扁桃体炎，颈淋巴结结核，小儿疳积，痔疮；外用治疔疮。该植物广泛分布于全国各省市，资源丰富13。我们曾研究发现马棘醇提取部位具有显著镇痛作用

6、4。本研究探讨70%马棘醇提物（IPM）对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响。1 材料与方法1.1 试剂与仪器Gibco公司DMEN培养基和小牛血清；抗LDL-R多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；LDL（中国协和医科大学基础生化所）；大连宝生物工程有限公司逆转录系统和PCR core system；引物（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国协和医科大学细胞中心）；其他试剂为国产分析纯。上海第三分析仪器厂722 型分光光度计；日本 Olympus 公司XDP-1倒置显微镜；SHELDON LAB 公司TC 2323 型CO2 培养箱；依地酸（EDTA，

7、sigma公司），3,3二氨基联苯胺（DAB）。1.2马棘醇提取物的制备5马棘枝叶采自湖北建始，经湖北民族学院鲁开功教授鉴定为豆科植物马棘（Indigofera Pseudotinctoria Matsum，IPM），经10倍量70%乙醇回流提取两次，过滤，浓缩蒸干，研末，收率为14.3%。1.3 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的培养6，7细胞培养瓶中接种RAW 264.7，调至pH 7.27.4，含胎牛血清10、链霉素l×105 U·L-1、青霉素1×108 U·L-1的DMEN培养液，通以5 % CO2恒温37培养4872 h，细胞融合后，用0.1

8、胰蛋白酶和EDTA0.08 %的混合消化液消化传代。实验前将细胞接种于细胞培养板，在无血清、无酚红的培养液中通以5 % CO2，37，培养12 h备用。1.4 氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的制备6,7将LDL置于恒温37、pH 7.2的PBS溶液（CuSO4，10 mol·L-1）透析24 h，在含0.1 % EDTA的PBS中透析24 h终止反应，0.22 m微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反应物质值来表示。结果OX-LDL为 21.4 mol·L-1，LDL为 2 .2 mol·L-1，说明LDL被氧化。1.5 动物分组共分6组，即：

9、对照组（control group,CG）；OX-LDL组（OX-LDL group,OLG）；肝素组（100 mg·L-1,heparin group,HPG）；IPM 100，200，400 mg·L-1保护组（IPM-100,200,400）。取细胞计数为1×108个细胞·L-1的备用传代培养细胞，按每孔500l 接种于6孔板，每组5孔，12 h细胞融合后，更换无血清无酚红DMEN培养液，后4组（HPG和IPM-100,200,400）分别加入相应浓度的肝素和IPM预处理，培养12 h后，除CG外，其余各组分别加入50 mg·L-1OX-

10、 LDL培养 24h 获细胞。1.6 LDL-R表达的检测（免疫酶标记法，SABC）6取细胞爬片，内源性过氧化酶以3% H2O2灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠LDL-R一抗，4，次日加山羊抗兔lgG二抗；加SABC复合物，DAB-H2O2显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同VIDAs图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 中LDL-R相对含量以细胞平均吸光度A值表示。1.7 LDL-R mRNA表达的检测（逆转录聚合酶链反应，RT-PCR）7按Trizol试剂说明一步法提取各组细胞总RNA。取总RNA 4 l按试剂说明逆转录合成cDNA，取2 l加入

11、25 l反应体系扩增，PCR扩增条件为：94，5 min；94，45 s；52,45 s , 72，1 min, 30个循环，7210 min。扩增后的LDL-R上游引物：5 ' TCC ATC TTC TTC CCT ATT GC 3 '，下游引物：5 ' CAG CCC AGC TTT GCT CTA 3 '，合成360 bp片断。内参照-肌动蛋白上游引物：5 ' TAT CCT CTC CCT CAC CCC ATC3 '，下游引物：5 ' TCA GTA ACA CTC CGC CTA CAA3 '，合成639 bp片断P

12、CR产物。用1琼脂糖凝胶电泳显影，结果用天方凝胶图象分析软件分析，各组LDL-R mRNA 表达差异定量用各组目的基因与内参照基因的吸光度（A）比值来表示。1.8 统计学分析各组数据采用±s表示，配对比较采用t检验。2 结果2.1 IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA表达的影响各组细胞均有LDL-R mRNA 表达，OX-IDL与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作用24h后，能明显降低LDL-R的mRNA表达，与CG比较，有显著性差异（P<0.01）；IPM-100,200,400 mg·L-1均能提高LDL-R mRNA的表达，且呈现浓度依赖趋势

13、，以IPM-400 mg·L-1作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）.结果见图1及表1。表1 IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA表达的影响（略） 2.2 IPM对RAW264.7细胞LDL-R蛋白表达的影响LDL-R免疫组化结果显示，各组细胞均有LDL-R表达，表达强弱有明显差别；OX-LDL与 RAW264.7细胞作用24 h后能显著降低 LDL-R蛋白表达，与CG比较有显著差异（P<0.01）；IPM对OX -LDL引起的LDL-R表达下调均有保护作用，以4

14、00 mg·L-1组作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.01）；肝素（100 mg·L-1）对OX-LDL引起的LDL-R表达下调无明显作用，与CG相比无显著差异（P>0.05）。结果见表2。表2 IPM对RAW264.7细胞LDL-R 蛋白表达的影响（略）3 讨论 动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，其主要成因与脂质代谢紊乱有关8。流行病学及实验研究发现，血浆低密度脂蛋白（LDL）浓度与AS的发生呈正相关9。最新研究发现，LDL受体（LDL-R）对调节体内的胆固醇平衡，降低血浆LDL

15、浓度起关键性作用，因而LDL-R功能的缺陷和异常是引起脂质代谢紊乱主要原因10。LDL-R是一种细胞表面糖蛋自，能与血浆中两种致AS脂蛋白（LDL和VLDL）结合，介导内吞和胞内分解，所以LDL-R对调节血浆总胆固醇（TC ) 含量起着关键作用11。因此，通过调控LDL-R的活性控制高脂血症，可以预防AS的发生与发展9。LDL-R基因表达调控的分子机制是：转录水平LDL-R基因启动子的激活和抑制、胆固醇类分子的负反馈抑制以及转录后mRNA分子稳定性的提高与降低10。LDL-R 基因转录的调控主要由胞内胆固醇（负反馈抑制性机制）和非胆固醇分子介导，前者涉及胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP1和S

16、REBP2）的合成及与LDL - R基因启动子胆固醇调节元件（SRE1）的结合11。当胆固醇浓度降低时，SREBP便结合到SRE1上，激活LDL-R基因转录，这一机制对于保持细胞的胆固醇平衡有重要意义10。非胆固醇介导的调控机制则通过蛋白激酶MEK/ERK信号转导进行，并与LDL-R基因启动子中的重复序列3有关9。 本研究发现OX-LDL可降低LDL-R表达，与有关报道一致8。其机制可能为细胞摄取 OX-LDL后，使胞内胆固醇浓度升高，通过由胆固醇介导的负反馈抑制性机制，抑制了 SREBP与SREI结合，进一步抑制LDL-R转录与翻译10。IPM可逆转OX-LDL对LDL-R的下调，而且呈现浓

17、度依赖趋势。其作用机制可能是：抑制泡沫细胞的形成，降低胞内胆固醇含量有关9，即通过降低胞内胆固醇含量，减少胆固醇介导的对LDL-R表达的负反馈抑制性，而增加LDL-R的表达10；IPM也可能通过蛋白激酶MEK/ERK信号转导途径，干扰LDL-R的转录所致11。这可能是其抗AS的作用机制之一，其详细的作用机制尚有待于进一步探讨。【参考文献】 1全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编，上册M.北京：人民卫生出版社，1975：84.2方志先，廖朝林.恩施药用植物志，上册M.武汉：湖北科学技术出版社，2006：525.3张水利，朱伟英 马棘皮的生药鉴定J.中药材，2001，24（1）：28.4胡泽华.

18、马棘不同提取部位对小鼠镇痛作用的研究J.时珍国医国药，2007，18(10):2442.5孙文基.天然药物成分提取分离与制备M.天津：中国医药科技出版社，1999：207.6汪韶君，刘赛，孙福生，等扇贝糖胺聚糖对巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响J.中国药学杂志，2007，42（3）：184.7huang C L , LIU SEffect of scallop skirt glycosaminoglycan on proliferation of rat vascular smooth muscle cells and the action of mechanismsJ.Chin J Pharmacol Toxicol，200