食品中有毒微生物的测定

1、 第十二章食品中有害成分测定食品中有害成分测定第二节diyijie食品中有毒微生物的测定目录12 食品中沙门氏菌的快速筛检方法345 李斯特菌快速检测方法微生物数量的快速检测大肠杆菌O157:H7快速检测方法金黄色葡萄球菌的快速检测方法 微生物数量的快速检测1.旋转平皿计数方法2.疏水性栅格滤膜法或等格法3.皿膜系统4.酶底物技术5.直接外荧光滤过技术6.“即用胶”系统活细胞计数的改进方法1.阻抗法2.ATP生物发光技术用于估计微生物数量的新方法旋转平皿技术方法旋转平皿技术方法标题旋转平皿计数方法即是把液态样品螺旋式并不断稀释地接种到一个旋转的平皿中。这一系统在美国已被广泛采用，如AOAC方法

2、977.27食品和化妆品中的细菌旋转平板法旋转平皿计数法测定原理原理:自食品或化妆品样品制备的菌悬液被螺旋平板注入器连续不断地注入分布到旋转着的琼脂平板的表面，在琼脂表面形成阿基米德螺旋形轨迹。当用于分液的空心针从平板中心移向边缘时，菌液体积减少，注入的体积和琼脂半径间存在着指数关系。培养时菌落沿注液线生长。用一计数的方格来校准与琼脂表面不同区域有关的样品量，计数每个区域的已知菌落数，再计算细菌浓度。“”疏水性栅格滤膜法或等格法常规微生物项目：菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希菌及霉菌、酵母计数，也有用于弯曲杆菌计数的报道。LIM等研制了台盼蓝的培养基使等格法能直接用于酵母菌计数。皿膜系

3、统皿膜系统可用于轮廓总数、大肠菌群、大肠埃希菌、霉菌、酵母和金黄色葡萄球菌计数。测定原理Happy every day5.12在一双层膜系统内含有干燥的营养物质和冷水可溶的胶体物质，以每系统1ML的加样量讲样品直接加到基础膜中间，盖上含有胶凝剂和2,3,5-氯化三苯四氮唑的覆盖膜，培养后细菌在双层膜之间生长并显色即可直接计数。测定原理测定原理底物酶技术直接外荧光过滤技术是测定许多食品如奶、肉、禽和禽制品、鱼和鱼制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、辐射食品等食品及水中的微生物的一种快速方法。直接外荧光过滤技术原理:利用紫外光显微镜来快速测定活菌数。首先用一特殊滤膜过滤样品，经吖啶橙染色后，用紫外光显

4、微观察活细胞呈橙色荧光、死细胞呈绿色荧光。“即用胶”系统是根据选择的培养基不同可分别用于菌落总数、大肠菌群、大肠埃希菌计数和霉菌、酵母计数，以及弯曲杆菌的计数。“即用胶”系统原理:此系统盛有无菌液体（或脱水干燥）培养基的试管，在此专用培养基内含有与多种细菌酶类所对应的底物，捡样被细菌污染时，只要具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基伞形酮，培养一定时间后，在波长365的紫外光下发出蓝色荧光。把样品倾入该试管中，混匀后再将混合物倒入一个装有胶质的特殊培养皿中。混合物与胶质接触后便形成与琼脂相似的复合物，经培养后根据颜色指示或在紫外光下产生荧光计数。用于估计微生物数量的方法123这些方法主要是

5、将物理化学领域中的新知识新技术应用于微生物检测中。通过测量微生物在生长和代谢活动中发生的变化来估测微生物数量。, ,Bactometer系统1 1Malthus微生物发光技术2 2阻抗法Bactometer系统是利用阻抗变化来测定，当培养基因微生物的代谢活动而发生化学改变时，阻抗也发生变化。在微生物生长过程中，大分子营养物质经代谢转变为较小但更为活跃的分子。在某些测定实例中，当细菌产生的离子浓度达到比培养基初始离子浓度稍低时，电导改变即可检出。ATP生物发光技术是利用产生于生物体内的化学发光现象而建立起来的一种检测方法。目前发现的荧光素酶有细菌荧光酶和萤火虫荧光素酶两大类，前者是从海洋放光细菌

6、中提取，后这是从萤火虫中提取。其方法是先将萤火虫萤光素酶基因克隆在大肠杆菌中表达，然后将转化体置37的LB培养基中培养，到对数期收集菌体，用渗透压法，冻融法提取细菌胞质组分，经均质，离心，用凝胶排阻，离心交换色谱提取纯酶。食品中沙门菌的快速筛检方法沙门菌 寄居在人类动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。它是人类食物中毒的主要病原之一。 沙门菌广泛分布于自然界，而且种类多，所以，沙门菌日益引起人们的高度重视，食品中的沙门菌的检验也显得非常重要。食品中沙门菌的快速筛检方法免疫学方法分子生物学方法沙门菌显色培养基法自动化传导法免疫学方法1单克隆酶免疫色度分析筛选方法2多克隆酶免疫分析筛选方

7、法3荧光酶免疫分析筛选方法4金标免疫分析方法分子生物学方法DNA探针检测法 DNA探针技术是最新发展起来的一向特异，灵敏，快速的检测方法。特别适用于直接检验出致病性微生物，而不受非致病性微生物的影响。 聚合酶链式反应【PCR】技术 该技术是由美国cetus公司和美国加利福尼亚大学于1985年联合创建的，自PCR方法创建以来其已广泛地应用于致病性微生物的诊断中。自动化传导法 自动化传导法是根据电阻抗测量的原理，关键是选用适宜的培养基，以保证任何电导或电阻抗的变化都是由目标微生物的生长所致，通过仪器检测电导或电阻抗的改变来确定是否存在被检微生物。 根据选用的专一性培养基不同，电导或电阻抗法还可用于

8、大肠杆菌，李斯特菌，弯曲杆菌等菌的初筛检验。也许对于大家而言，大肠杆菌已然并不陌生，但是你对于大肠杆菌O157：H7了解多少？它到底对于我们生活有何影响？接下来就让我们走进今天的学习大肠杆菌大肠杆菌O157：H7的特性介绍及检测它的意义的特性介绍及检测它的意义肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛。危害：本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎等多种人类病状密切相关。根据大肠杆菌O157：H7的某些生化特征设计些选择性培养基，在这些培养基上大

9、肠杆菌O157：H7与其他大肠杆菌或杂菌区分开。另一类根据菌落颜色来识别大肠杆菌O157：H7有法国梅里埃公司的“O157ID”，在这种培养基上大肠杆菌O157：H7显蓝色，其他大肠杆菌显紫色。1.免疫磁珠分离法：利用磁场作用将磁珠从增菌液中沉淀，用磷酸盐缓冲液反复冲洗，让成分分离2.金标免疫分析法：免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。3.酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。4.乳胶凝集实验：以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附可溶性抗原于其

10、表面，特异性抗体与之结合后，可产生凝集反应。1.DNA探针：DNA探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。2.聚合酶链反应：聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法金黄色葡萄球菌检验概况l葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。l葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌

11、。l金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。金黄色葡萄球菌的生物学特性形态与染色：l 金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，直径0.41.2m，大小不一，平均直径约为0.8m。l 革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。培养特性：l 易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。l 需氧或兼性厌氧。l 最适生长温度37，最适生长pH 7.4。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。l 在普通营养琼脂平板上培养1824，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生

12、金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。l 在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。l 可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。l 大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、 VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。金黄色葡萄球菌的酶l 金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。l 血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活

13、性。l 耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。该酶的最适pH为9.0。血浆凝固酶试验 l 试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白，附着于细菌表面 ，产生凝固。l 金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。血浆凝固酶试验 l 挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，361培养18 h24 h。 l 取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2

14、mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。 l 同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 l 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。 结果报告l如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌 。l报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。2015李斯特菌快速检测方法2015李斯特菌李斯特菌(学名:Listeria monocytogenes)，又名单核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，取名自约瑟夫李斯特。它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一。 2015 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品