分光光度法ppt课件

1、1 第六章第六章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 (UV-vis Spectrophotometry) 2内容提要第一节第一节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱三、三、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律第二节第二节 可见分光光度法可见分光光度法第三节第三节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差一、分光光度法的误差 二、提高测量灵敏度和准确度的方法二、提高测量灵敏度和准确度的方法3基本要求n掌握掌握Lambert-BerrLambert-Berr定律

2、以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。及相互关系。n熟悉可见分光光度法的测定方法熟悉可见分光光度法的测定方法标准曲线法。标准曲线法。n了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱的意义。了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱的意义。n了解提高测量灵敏度和准确度的方法。了解提高测量灵敏度和准确度的方法。4第一节第一节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱三、三、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律5分光光度法分光光度法 根据根据物质的吸收光谱及光的物质的吸收

3、光谱及光的 吸收定律吸收定律，对物质进行，对物质进行定性定性、定量定量分析的一分析的一种方法。种方法。6分光光度法特点分光光度法特点n灵敏度高灵敏度高 检测限检测限10-510-6mol.L-1适于微量组分测定适于微量组分测定n准确度高准确度高 相对误差相对误差25%n操作简便，测定快速。显色操作简便，测定快速。显色-测定测定n应用广泛应用广泛7第一节第一节 分光光度法分光光度法 基本原理基本原理入射光入射光 I0 吸收吸收Ia 透射透射It I0= Ia+ It+ Ir I0= Ia+ It一一、透光率透光率(T)(T)和吸光度和吸光度(A)(A) 8第一节第一节 分光光度法分光光度法 基本

4、原理基本原理透光率透光率(transmittance) T = It/ I0 吸光度吸光度(absorbance)一一、透光率透光率(T)(T)和吸光度和吸光度(A)(A) t0lglgII=T-=AT = 10-A 9第一节第一节 分光光度法分光光度法 基本原理基本原理 物质对光的吸收具有选择性，只有当光子的能量物质对光的吸收具有选择性，只有当光子的能量(h (h ) )与被照射物质粒子的与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差基态和激发态能量之差(E)(E)相等时才能被吸收。相等时才能被吸收。 M(基态)+ h M*(激发态) 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 10Why Absor

5、ption Occurs?Energy level: E0E1E1E1Ground level electronic Excited levelmolecular vibrationmolecular rotationUV/Vis infrared11 互补（色）光互补（色）光complementary colors第一节第一节 分光光度法分光光度法 基本原理基本原理 若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色。 12 用不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的用不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，分别测定其对不同

6、波长的吸光度，有色溶液，分别测定其对不同波长的吸光度，以波长以波长 为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，为纵坐标作图，即为吸收光谱即为吸收光谱(absorption spectrum)，或称吸，或称吸收曲线。收曲线。 (邻二氮菲邻二氮菲)合铁合铁(II) 的吸收光谱的吸收光谱 二物质的吸收光谱二物质的吸收光谱 max max 13峰形曲线，具有最大吸收波长峰形曲线，具有最大吸收波长maxmax。在此波长下，溶液吸光度最大。在此波长下，溶液吸光度最大。浓度越大，吸收峰越高浓度越大，吸收峰越高(A(A越大越大) )。同一物质不同浓度的溶液，吸收光谱基本形状相同。最大吸收波长同一物质不同

7、浓度的溶液，吸收光谱基本形状相同。最大吸收波长maxmax位置位置不变。不变。 吸收光谱的特点吸收光谱的特点: : 14同一物质的同种溶液同一物质的同种溶液maxmax不随物质的浓度而变。不随物质的浓度而变。maxmax与溶剂有关。与溶剂有关。不同物质不同物质, ,maxmax不同不同, ,maxmax是定性分析的依据（与吸光系数结合）。是定性分析的依据（与吸光系数结合）。 定量分析时，用定量分析时，用maxmax的单色光作入射光，灵敏度最高。的单色光作入射光，灵敏度最高。maxmax重要参数重要参数 15 当入射光波长、强度、溶剂、吸光物质的种类和溶液温度一定时，当入射光波长、强度、溶剂、吸

8、光物质的种类和溶液温度一定时，A与液层与液层厚度厚度b和溶液浓度和溶液浓度c 有关：有关： c 一定一定, Ab Lambert b 一定一定, Ac Beer A =bc三、三、 Lambert Beer 定律定律16三、Lambert-Beer定律n A = bc 溶液厚度溶液厚度b, 单位单位:cm 浓度浓度c，单位，单位mol L-1 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 ，单位，单位L mol -1 cm-1 n若用质量浓度若用质量浓度 代替代替cA = ab 质量浓度质量浓度 , 单位单位: g L-1 质量吸光系数质量吸光系数a, 单位单位: L g -1 cm-1 17吸光系数吸光系数 n

9、与入射光的波长、物质的性质、溶剂和温度有关；与浓度无关；与入射光的波长、物质的性质、溶剂和温度有关；与浓度无关；n 103，可用于定量测定；，可用于定量测定；n与与maxmax一起可以作为定性的依据。一起可以作为定性的依据。18A =bc A ab = aM T =10- bcLambertbeer定律定律 19适用条件适用条件 Preconditions:nParallel & Monochromatic incident lightnHomogeneous medianNo emission, scattering or photo-chemical reactionsnlow c

10、oncentration(c0.001molL-1)20A1=1bc1A2=2bc2A=A1 +A2 =1bc1+ 2bc2 吸光度的加合性吸光度的加合性 Addition of A 21例：测试酶与腺苷酸例：测试酶与腺苷酸(AMP)混合体系的吸光度如下混合体系的吸光度如下A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58， 试计算每一组分的浓度。试计算每一组分的浓度。已知：酶的已知：酶的 (280nm) = 2.96 104L mol-1 cm-1 (260nm) = 1.52 104L mol-1 cm-1AMP的的 (280nm) = 2.4 103L mol-1 cm-1

11、 (260nm) = 1.5 104L mol-1 cm-1吸收池厚度为吸收池厚度为1.00cm。 22A1= 1bc1A2= 2bc2A=A1 +A2 = 1bc1+ 2bc2A(280nm) = 0.46= (280nm) bcA(260nm) = 0.58= (260nm) bc23第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法 1. 1. 标准曲线法标准曲线法 n配制系列浓度标准溶液；配制系列浓度标准溶液；n测定系列标准溶液吸光度测定系列标准溶液吸光度A A，作吸光度，作吸光度A A对溶液浓度对溶液浓度c c的图，得过坐标的图，得过坐标原点的直线原点的直线-标准曲线；标准曲线；n在相同条件

12、下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。2425 2. 标准对照法标准对照法 先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用其浓度用cs表示表示)，在，在 max处测出处测出吸光度吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度，则试样溶液浓度cs可按可按下式求得：下式求得： Ax /As= cx / cs cx = cs Ax /As26I 参比溶液的作用：扣除一切不来源于参比溶液的作用：扣除一切不来源于 目标产物目标产物的光吸收

13、。的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。常用参比溶液：常用参比溶液：溶剂空白溶剂空白试剂空白试剂空白 试样空白试样空白 参比参比（空白）（空白）溶液溶液 blankblank27常用参比溶液常用参比溶液成份成份溶剂溶剂显色剂显色剂试试 样样其他其他适用范围适用范围溶剂空白溶剂空白显色剂、试样显色剂、试样均无吸收均无吸收试剂空白试剂空白试样无吸收显试样无吸收显色剂有吸收色剂有吸收试样空白试样空白显色剂无吸收，显色剂无吸收，试样有吸收试样有吸收28第四节第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法自学自学 重点看：重点看：

14、分光光度法的误差来源分光光度法的误差来源显色剂的选择显色剂的选择测定条件的选择测定条件的选择29本章小结本章小结n基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，最大吸收波长，显色剂，参比基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收曲线，标准曲线溶液吸收曲线，标准曲线n 基本计算：基本计算：A =bcn 测定方法：标准曲线法测定方法：标准曲线法 标准对照法标准对照法 t0lglgII=T-=A30判断题判断题1. 分光光度法灵敏度高，特别适用于常量组分的测定。分光光度法灵敏度高，特别适用于常量组分的测定。 （ ）2. 光照射有色溶液时，光照射有色溶液时，A与与T的关系为的关系为l

15、gT=A。 （ ）3. 当某一波长的单色光照射某溶液时，若当某一波长的单色光照射某溶液时，若T=100%，说明该溶液对此波长的，说明该溶液对此波长的光无吸收。光无吸收。 （ ）314. 符合符合Lambert-Beer定律的某有色溶液，其他条件一定，浓度越大，吸光定律的某有色溶液，其他条件一定，浓度越大，吸光度越大。（度越大。（ ）5. 如果吸收池的厚度增加如果吸收池的厚度增加1倍，则溶液的透光率将减少倍，则溶液的透光率将减少1倍。倍。 （ ）6. 吸光系数与入射光波长、溶剂及溶液浓度有关。吸光系数与入射光波长、溶剂及溶液浓度有关。 （ ）327. 愈大，表明溶液对入射光愈易吸收，测定的灵敏度

16、愈高。愈大，表明溶液对入射光愈易吸收，测定的灵敏度愈高。 （ ）8. 一般一般 值在值在103以上即可进行分光光度法测定。以上即可进行分光光度法测定。 （ ）9. 吸收曲线的基本形状与溶液浓度无关。吸收曲线的基本形状与溶液浓度无关。 （ ）33二、选择题二、选择题 1关于关于Lambert-Beer定律，下述正确的是定律，下述正确的是 A. 该定律仅适用于可见光区的该定律仅适用于可见光区的单色光。单色光。B. 该定律仅适用于有色物质的含量测定。该定律仅适用于有色物质的含量测定。C. 其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度和吸光系数都会改变。其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度和吸光系数都会改变。D.

17、 其他条件不变，入射光波长改变，吸光度和吸光系数都会改变。其他条件不变，入射光波长改变，吸光度和吸光系数都会改变。342在分光光度法中吸光度在分光光度法中吸光度A可表示为可表示为 A. It/I0 B. 1/T C. lgT D. lg(I0/It) 3下列各式哪些不符合下列各式哪些不符合L-B定律定律 A. T=10 bc B. 1/T= 10 bc C. T=-lgA D. lg(1/T)= bc354在可见分光光度法中，影响吸光系数的因素是在可见分光光度法中，影响吸光系数的因素是 （ ） A. 入射光波长入射光波长 B. 溶液浓度溶液浓度 C. 溶液厚度溶液厚度 D. 入射光强度入射光强

18、度365下面说法正确的是下面说法正确的是A. 吸收光谱的基本形状与溶液的浓度无关吸收光谱的基本形状与溶液的浓度无关B. 吸收光谱与物质的特性无关吸收光谱与物质的特性无关 C. 浓度愈大，吸光系数愈大浓度愈大，吸光系数愈大D. 其他因素一定时，吸光度值与测定波长成正比其他因素一定时，吸光度值与测定波长成正比E. 波长一定时，测定不同浓度溶液的波长一定时，测定不同浓度溶液的A值可绘制吸收光谱曲线值可绘制吸收光谱曲线376符合符合Beer定律的某有色物质溶液，当其浓度改变时，其吸收光谱曲线上的最定律的某有色物质溶液，当其浓度改变时，其吸收光谱曲线上的最大吸收峰的位置将大吸收峰的位置将 （ ） A. 向短波方向移动向短波方向移动 B. 向长波方向移动向长波方向移动 C. 不改变，但峰高度改变不改变，但峰高度改变 D. 不改变，峰高度也不变不改变，峰高度也不变 E. 改变，但峰高度不变改变，但峰高度不变387分光光度法中使用试剂空白作对照的目的是：分光光度法中使用试剂空白作对照的目的是： A. 用以消除仪器测量误差用以