实验一质粒DNA的小量制备ppt课件

1、质粒质粒DNADNA的小量制备的小量制备基础植物生物技术基础植物生物技术基础植物生物技术基础植物生物技术提纲目的1原理2资料3方法4本卷须知5基础植物生物技术基础植物生物技术一、目的掌握一种较常用的提取质粒DNA的方法基础植物生物技术基础植物生物技术二、原理 碱变性法提质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异从而达到分离的目的。细菌悬浮液暴露于高pH (8.0)条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；而质粒DNA在拓扑结构上是相互缠绕的超螺旋共价闭合环状结构，因而它在高pH (8.0)条件下，两条互补链不会完全分离。当以pH 4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH到

2、中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而保存在上清夜中; 而细菌蛋白质破裂细胞壁和变性的染色体DNA相互缠绕形成网状复合物，通过离心这些复合物能够有效地被沉淀下来而被除去。基础植物生物技术基础植物生物技术三、资料 (一) 仪器 超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；摇床；2102型分光光度计；Eppendorf 5417C 常温高速离心机；XW-80型旋涡混合器；电热恒温水浴锅；低温冰箱(-20)-70)；稳压电泳仪(0500V，0300mA)；Chemi-Smart 2000/3000型化学发光及凝胶成像系统；基础植物生物技术基础植物生物技术 (二) 器皿 刻度摇菌管，微量移液器，标记笔,

3、 EP管 (三)菌种 大肠杆菌DH-5中的Hm质粒 (四)培养基 LB液体培养基： 蛋白胨10克酵母提取物5克和氯化钠10克用蒸馏水溶解至1000毫升，用10 mM NaOH调至pH 7.2-7.4, 湿热灭菌20分钟。 三、资料基础植物生物技术基础植物生物技术 (五)试剂 1溶液I50mM葡萄糖10mM EDTA 25mM Tris-HCI(pH 8.0) 配制方法 ： 吸取母液1M葡萄糖2.5毫升; 0.5 M EDTA 1毫升; 1M Tris-HCI (pH 8.0) 12.5毫升,加无菌水至50毫升 2溶液0.2 M NaOH；1 SDS配制方法： 1M NaOH 2毫升10 SDS

4、 1毫升加无菌水至10毫升 3溶液KAC (pH 4.8) 缓冲溶液配制方法： 5M KAC 60毫升冰醋酸 11.5毫升加无菌水至100毫升三、资料基础植物生物技术基础植物生物技术(五)试剂4.10毫克毫升RNaseA： 称取10毫克RNaseA放于灭菌的EP管中，加1毫升TE沸水浴15分钟，室温冷却后-20保管。5.10SDS溶液: 用70无菌水初步溶解10克SDS，后65水浴1小时助溶。6.TE缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA。三、资料基础植物生物技术基础植物生物技术(五)试剂 7.Tris饱和酚 8.氯仿-异戊醇(24:1)： 取240毫升氯仿

5、，加入10毫升异戊醇,充 分混匀 9.预冷无水乙醇： 无水乙醇保存在-20冰箱中备用。 10.TAE电泳缓冲液： 40 mM Tris-HCI(pH 8.0)、20 mM NaAC、2 mM EDTA。三、资料基础植物生物技术基础植物生物技术(五)试剂11.溴酚蓝指示剂溶液：0.2溴酚蓝、40蔗糖 配制方法：0.2克溴酚蓝、40克蔗糖用100毫升无菌水充分溶解，4保管。12. 0.8% 琼脂糖制备 配制方法：用100毫升TAE电泳缓冲液加上0.8克琼脂糖加热完全溶解后，加入6微升10 毫克/毫升EB 于45倒入插有点样梳的制胶槽。三、资料基础植物生物技术基础植物生物技术四、方法1取平板活化后的

6、菌落接种于含50毫克升 Kan的LB液体培养基，37振荡培养过夜。 平板活化震荡培养 接种于LB培养基加50毫克/升Kan基础植物生物技术基础植物生物技术四、方法2取1.5毫升培养物，加入1.5毫升EP管中，于室温下12000rpm 离心30秒； 15毫升摇菌管1.5毫升离心管高速离心机基础植物生物技术基础植物生物技术四、方法3取沉淀，重悬于100微升溶液I，于XW-80型旋涡混合器 上完全分散，室温放置5分钟； 4加人新配的溶液200微升，盖紧管口, 立即反复倒置 5次，室温放置5分钟；5加入溶液150微升，倒置混匀，于冰上放置10分钟；加溶液加溶液I加溶液加溶液 加溶液加溶液 基础植物生物技术基础植物生物技术612000 rpm离心10分钟，取上清，计算体积；7加入等体积的酚和氯仿-异戊醇(24:1)，混合后于12000 rpm离心10分钟，取上清，加入1.5毫升EP管，计算体积；8加人2倍体积预冷无水乙醇沉淀核酸，室温放置10分钟；四、方法加氯仿-异戊醇 加无水乙醇基础植物生物技术基础植物生物技术912000 rpm离心 10分钟、小心除去上清，将离心管 倒置于纸巾上；10加70乙醇1毫升，盖紧管口清洗沉淀，12000 rpm 离心10分钟;11取