实验碱性磷酸酶米氏常数的测定ppt课件

1、实验五实验五 碱性磷酸酶米氏常碱性磷酸酶米氏常数的测定数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数Km及最大反应速度Vm的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一利用吸收光谱对物质进行定性分析1原理2主要方法： （1比较吸收光谱曲线 （2比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸（3比较吸光度的比值 纯DNA8 . 1280260nmnmAA（二利用吸收光谱对物质进行定量分析1原理Beer-Lambert比尔定

2、律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2常用方法（1标准曲线法 OD或浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-S曲线 v S推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 SKSVvmm米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它

3、包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线mmmVSVKv111 1/v 1/Vm -1/Km 1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：试剂： 0.5mol/mL pN

4、P 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠碳酸钠碳酸氢钠碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 mg/mL碱碱性磷酸酶酶液性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、器材：恒温水浴锅、722分光光度计分光光度计四、分光光度计的使用 1722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定键MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T键：用于自动调整零透射比“波长设置旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用

5、“波长设置按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按“0%T键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T调100%透射比 按“方式键”（MODE将测试方式设置为吸光度方式(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T调零A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。前往前往前往五、操作方法五、操作方法（一对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试

6、管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为

7、纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。(二测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No. 1 2 3 4 5底物终浓度S (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 310 mmol/L pNPPmL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6蒸馏水mL ） 0.5 0.45 0.4 0.3 0 碳酸盐缓冲液mL ） 各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2 mL 预热 混匀，37，5分钟酶液mL ） 测定管各加0.2 mL酶液 反应时间 37，精确反应10分钟0.1 mol/L NaOHmL） 各加2 mL 酶液m

8、L ） 空白管各补加0.2 mL酶液 OD405（三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。六、 本卷须知 取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。空白对照一定要先加NaOH，后加酶。测定OD405时要以各自的空白调零点。移液管或取液器的使用比色杯的使用前往管号1122 33 44 55 加酶时间（min）0.511.522.533.544.55加NaOH时间10.5 1111.5 1212.5 1313.5 1414.5 15反应时间（m