第八章动物早期胚胎操作

1、第八章 动物早期胚胎操作 一、胚胎移植技术 二、胚胎分割技术 三、嵌合体技术 四、细胞核移植技术第一节、胚胎移植技术第一节、胚胎移植技术 一、胚胎移植的概念及生理基础和原则：一、胚胎移植的概念及生理基础和原则： 概念：概念：借助一定的器械，从一头优良雌性借助一定的器械，从一头优良雌性动物的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移动物的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头处于相同生理阶段的雌性动物植到另一头处于相同生理阶段的雌性动物的相应部位，使之继续发育成为新个体。的相应部位，使之继续发育成为新个体。即即借腹怀胎借腹怀胎。 供体：供体：提供胚胎的个体，一般为良种。提供胚胎的个体，一般为良种。 受体：

2、受体：接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时间和空间。间和空间。胚胎移植的意义 1. 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，加快优良品种的改良。对牛羊等繁殖力较低的优对牛羊等繁殖力较低的优良品种来说，结合人工受精技术可克服其良品种来说，结合人工受精技术可克服其产仔数和世代间隔的限制。产仔数和世代间隔的限制。 2. 体外受精、胚胎嵌合和核移植等技术都必须通过胚胎移植获得活体。 3. 结合胚胎冷冻可长期保存珍贵遗传资源，并且方便它们的运输。一）胚胎移植的生理学基础 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和外源激素

3、作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个排卵数可达十数个 每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育 早期胚胎处于游离状态早期胚胎处于游离状态 胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育不存在免疫问题 胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系联系 胚胎的遗传性不受受体的影响胚胎的遗传性不受受体的影响二）胚胎移植的基本原则 胚胎移植前后所处的环境的同一性胚胎移植前后所处的环境的同一性 供体和受体在分类学上的相同属性。供体和受体在分类学上的相同属性。 动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间

4、上的同期性。同期性。 动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性 胚胎发育的期限：胚胎发育的期限：胚胎日龄不能超过周期黄体的寿命。胚胎日龄不能超过周期黄体的寿命。 胚胎的质量：胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响。受不良因素的影响。至目录二、胚胎移植的技术程序二、胚胎移植的技术程序 1.供体和受体的选择供体和受体的选择 2.供体的超数排卵处理供体的超数排卵处理 3.同期发情处理同期发情处理 4.供体早期胚胎的收集供体早期胚胎的收集 5.胚胎的检查胚胎的检查 6.胚胎的保存与培养胚胎的保存与培养 7

5、.胚胎的移植胚胎的移植 8.供体和受体的术后观察供体和受体的术后观察一）供体和受体的选择一）供体和受体的选择 供体应具有相当高的育种价值供体应具有相当高的育种价值 供体生殖机能应处于较高的状态：无生殖供体生殖机能应处于较高的状态：无生殖系统疾病，体质强健系统疾病，体质强健 受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种应性强，体型中上等，非优良品种 受体健康状况良好，已进入发情季节受体健康状况良好，已进入发情季节 供受体发情时间应接近或一致供受体发情时间应接近或一致二）供体的超数排卵处理二）供体的超数排卵处理 超数排卵： 雌性动物间情期内

6、，注射外源促性腺激素，诱发其卵巢上大量卵泡发育并排卵的方法称为超数排卵 超排原理： 外源激素可以改变卵巢上只有一个或少数卵泡成熟排卵的定势，解除单胎动物优势卵泡发育对同一拨其他卵泡发育的抑制作用，促使同一拨卵泡群中大部分卵泡能够发育成熟并排卵。 动物常用超排激素： PMSG、FSH、LH、PGF2、GnRH、hCG等 超数排卵的意义 采用超数排卵可大大增加每次的排卵数量 在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎，可以满足胚胎工程研究、遗传工程研究和建立胚胎库的需要。大大缩短了研究周期 在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产量，增加经济效益。1.小鼠的超数排卵 腹腔注射PMSG 10U，一

7、般选择在中午注射，间隔48小时后注射HCG，光照周期保持1214h，超数排卵方法超数排卵方法2.2.牛的超数排卵牛的超数排卵 1 1）促卵泡素）促卵泡素(FSH)(FSH)减量注射法减量注射法：供体牛在发情：供体牛在发情后的后的9 913d13d肌注肌注FSHFSH，早晚各一次，间隔，早晚各一次，间隔12h12h，分，分4d4d减量注射。在第减量注射。在第3d3d时同时宫注时同时宫注PGFPGF222.02.02.4mg2.4mg或氯前列烯醇或氯前列烯醇0.6mg0.6mg。如使用国产。如使用国产FSHFSH总剂量为总剂量为325325单位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不单位时，处理方法

8、如附图所示。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，国产激素同厂家激素确定适宜剂量，国产激素320320360360单单位，进口激素位，进口激素282836mg36mg。牛超数排卵示意图牛超数排卵示意图2）.PMSGPMSG法法孕马血清促性腺激素孕马血清促性腺激素(PMSG)(PMSG)处理法处理法在情期的在情期的111112d12d，一次肌注，一次肌注PMSG2500PMSG250030001U30001U，48h48h后宫注后宫注PGFPGF222.4mg2.4mg。发情后约。发情后约18h18h肌注等量的肌注等量的抗抗PMSGPMSG。发情观察和配种发情观察和配种 PGF PGF22处理后

9、处理后404048h48h，大部分处理牛发情。，大部分处理牛发情。通常要求从注通常要求从注PGFPGF第第2d2d傍晚开始观察发情，至少傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后4 46h6h进进行第一次输精，间隔行第一次输精，间隔12h12h后第二次输精。每次有后第二次输精。每次有效精子数不得少于效精子数不得少于505010106 6，输入两侧子宫角或，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。 3.羊的超数排卵 可采用牛的超排处理方法，FSH减量注射或PMSG + PGF2法。 也可采用如下方法： 每日肌

10、注孕酮10-12mg，连续处理约14d后，一次性肌注PMSG10002000IU，12天配种。 影响超数排卵的因素： 1. 动物个体状况： 不同个体对激素的敏感性不同 动物的遗传基础的差异 动物的年龄差异 2. 外界环境因素： 季节 光照周期 气候条件及动物营养水平 3. 药物因素：PMSG、FSH等 4. 激素的注射部位及超排程序三）同期发情（一）同期发情（同步发情）：用人工的方法对母畜发情周期进行同期化处理的方法叫同期发情。在胚胎移植技术中，受体子宫和供体胚胎处于高度同步化状态才有利于移植胚的发育。1.同期发情在畜牧生产中的意义：A.便于集中或定时对一群母畜进行输精；B.可做到同期配种，从

11、而使母畜的妊娠、分娩、幼畜的培育相对集中，提高生产效率和经济效益。C.利于家畜的胚胎移植技术的应用。2.同期发情的机理：主要是借助外源激素对卵巢的作用，使被处理的母畜卵巢按预定的要求发生变化，并使其功能处于一个共同的基础之上，达到同期表现发情的目的。目前的同期发情技术有两种方法： A.用孕激素处理抑制卵巢上卵泡的生长发育和发情表现，待所有处理母畜的自然黄体退化，功能消失后，同时停药；此时，由于卵巢失去了孕激素的抑制作用，于是卵泡又迅速发育并表现发情。 B.采用具有溶黄体作用的前列腺素及其类似物，使卵巢上的功能黄体同时迅速溶解、消退，使卵泡解除抑制并迅速发育，从而导致母畜的同期发情。3.用于同期

12、发情的激素和使用方法：用于同期发情的激素及其类似物可分两类： 一是抑制卵巢上的卵泡发育和发情表现的孕激素类物质； 二是促使黄体溶解和消退的前列腺素制剂； 另外，还有一些是在以上两类激素施用基础上，为获得更好的发情和受胎效果，用来促进卵泡的生长、成熟和排卵的一些辅助激素，主要有：促卵泡素、促黄体素、孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素和促性腺激素释放激素（GnRH)等。四）供体早期胚胎的收集 胚胎的收集是指在配种或输精后的适当时间，从超排供体回收胚胎，以准备给受体移植，简称采胚。 一般将配种当日记为0天，从配种后第二天开始计算采胚天数。 不同动物早期胚胎发育速度和到达子宫的时间各有差异（p31

13、4，表12-3），应根据采胚目的来选择合适的采胚时间。 采胚方法： 大家畜：手术法 非手术法 小鼠等实验动物：处死动物，解剖法。 手术法： 早期胚胎（如4d以前）的收集： 剖腹，拉出输卵管和子宫，从子宫角尖端（牛、羊）或输卵管末端（猪）注入冲胚液，从输卵管伞部接取冲胚液。 晚期胚胎（胚胎已经进入子宫角）的收集： 从子宫角上端注入3050ml的冲胚液，由基部接取，或由基部入针，从上端接取。大动物手术法采胚大动物手术法采胚 非手术法： 此法一般适宜配种后6-8天胚胎的收集。 母畜保定-尾椎硬膜外腔麻醉-插入三通管-由充气孔注水或气体至气球膨胀，使子宫角基部堵塞-30-60ml冲胚液从注射孔灌入，充

14、满整个子宫角-辅以按摩子宫，或将子宫角倒提等方法令冲胚液回流，从回收孔收集。 小鼠等实验动物的采胚：（1）输卵管采胚法： 以脱颈椎法杀死受精1天后的母鼠（此时胚胎一般处于2细胞期），暴露子宫、输卵管；剪下子宫、输卵管，置于平皿中；在灭菌平皿中剪下输卵管置入盛有冲卵液的集卵杯中，在体视显微镜下撕开壶腹部，释放受精卵并用用新鲜的培养液洗12次。 用透明质酸酶处理受精卵细胞团 （2）子宫采胚法： 受精后6072小时，一些致密的8细胞胚胎已进入子宫。而桑椹胚和囊胚的收集则一定要从子宫中获得。 需熟悉小鼠胚胎着床前发育过程（p316 图12-6）五）供体胚胎的分级检查五）供体胚胎的分级检查 冲胚液回收后

15、，应立即收集冲胚液中的胚胎，并进行质量检查。 形态学标准：教材P318、P319 形态大小正常，卵裂球均一，透明带完整等。 采卵时间与胚胎发育时间是否吻合。六）六） 胚胎移植胚胎移植 手术法胚胎移植：大动物非手术法胚胎移植 目前牛的胚胎移植主要采用非手术法。人工受精管中装入胚胎，通过子宫颈后注入所装胚胎即可。 注意： 移植前应保证受体牛生殖道无病理情况 移植中要尽量减少对生殖道的刺激，以免引起子宫收缩排出移植胚。 在体视显微镜下观察输卵管伞，并用移卵管吸取胚胎，次序为石蜡油、空气泡1、培养液、空气泡2、胚胎(尽可能少带入培养液)。空气泡3、培养液。 七）影响胚胎移植成功率的因素七）影响胚胎移植

16、成功率的因素 1. 胚胎因素：胚胎因素：胚胎的质量、发育阶段、数量、供体质量、体外停留时间等。 2. 母体因素：母体因素：供受体发情的同期化程度、受体孕酮水平、移植部位、受体营养水平、受体子宫等生殖系统状态等。 3. 其他因素：其他因素：移植方法、污染程度、操作熟练程度等。第二节、胚胎分割技术 胚胎分割(embryo splitting)是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。 在畜牧生产上，胚胎分割可用来扩大优良家畜的 数量;在实验生物学或医学中，运用同卵孪生后代 作实验材料，可消除遗传差异，提高实验结果的 准确性。一、

17、胚胎切割的基本程序 1.切割器具的准备切割器具的准备 器械：器械：倒置显微镜和显微操作仪。 胚胎固定管：胚胎固定管：末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为2030um。 切割针：切割针：玻璃针和微刀两种。玻璃针一般用实心玻璃棒拉成，微刀是用锋利的金属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成 玻璃针进行胚胎分割微刀进行胚胎分割 2.胚胎预处理：胚胎预处理： 为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或者在显微操作仪下直接去除透明带。 3.胚胎分割方法：胚胎分割方法： 1）willadsen法 2）williams法法 3）铃木分割法 4）显微吸管分割法 5）徒手

18、分割法 (1)桑椹胚之前的胚胎桑椹胚之前的胚胎 （Willianms分割法） 这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。 常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放人另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。 (2)桑椹胚和囊胚的分割桑椹胚和囊胚的分割 对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法，操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。在进行囊胚切割时，要注意将内细胞团等分（P325 图1218） 。4.分割胚的培养 为提高半胚移植的妊娠率

19、和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。 半胚的体外培养方法基本同于体外受精卵。 体内培养的中间受体一般选择绵羊、家兔等动物的输卵管，输卵管在胚胎移入后需要结扎以防胚胎丢失。 琼脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影响胚胎的发育。 发育良好的胚胎可移植到受体内继续发育或进行再分割. 二、影响胚胎分割效果的因素 一）分割胚的发育 1. 透明带的作用：保护作用 2. 胚胎分割程度：分割程度越高，分割胚囊胚发育成功率越低。 3. 胚胎不同发育阶段：牛分割胚实验表明，来自囊胚的半分割胚发育成功率要高于桑葚胚的半分割胚。 二）影响胚胎分割效果的因素

20、1. 分割胚胎发育的阶段 2. 胚胎分割的次数 3. 操作液 4. 动物种类 5. 分割胚的移植 2008年9月9日下午5时，小公犊“明明”在广西水牛研究所顺利诞生，它是世界首例胚胎分割-性别鉴定试管水牛，这意味着水牛性别控制又找到了一条具有实用价值的新途径。图为9月10日下午，一身黝黑的“明明”（右）与另一头小牛犊在玩耍。(三)胚胎分割存在的问题 1.初生体重低 在牛切割胚胎移植实践中，发现有些分割胚即使培养到囊胚阶段，与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移植后代的体重也相应降低。 这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但发育机理还有待深入研究。 2.遗传一致性 同一胚胎切割后获得的后代，在理论

21、上，遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。 人们发现6-7日龄牛胚胎分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同， 而在2-细胞阶段分割， 却表现出遗传一致性。这种现象与胚胎细胞的分化有密切关系，但目前对不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力了解很少。 3.同卵多胎的局限性 从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限.迄今，最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。因此，通过胚胎分割技术生产大量克隆动物在目前还难以取得进展。 概念概念 嵌合体：同一个体中同时存在不同基因型的细胞或组织，这种个体成为嵌合体。 胚胎嵌合：把两个或多个不同基因型的早期胚胎

22、（细胞）聚集在一起形成复合胚胎，进而发育为不同程度嵌合个体的过程。第三节、嵌合体技术 研究意义：研究意义： 1.发育生物学领域：如不同基因嵌合体将来在组织中的分布、卵裂球的分化倾向等 2. 医学领域：建立人类疾病模型等 3. 动物生产上：培育杂种个体，甚至中间个体。如制作新型皮毛花色的嵌合动物；与ES嵌合还能生产转基因动物。 嵌合体胚胎制作方法：嵌合体胚胎制作方法： 1. 主要设备：显微操作仪、拉针仪、煅针仪、磨针仪等 2. 显微工具（毛细玻璃针）的制备： 固定针：内径2030um 注射针：拉针煅烧磨针洗涤胚胎嵌合操作方法胚胎嵌合操作方法 （1）聚合法）聚合法 卵裂球聚合法：P328图a （2

23、）注入法）注入法 细胞（卵裂球、ICM、ES等）显微注入囊胚腔中，与ICM合并，最后发育得到的个体即嵌合胚。P328图b嵌合体的分析与鉴定嵌合体的分析与鉴定 1 色素分析法： 简单、直观。如白鼠、黑鼠的嵌合情况分析。 2 同工酶分析法：GPI(磷酸葡萄糖异构酶分析)。待鉴定嵌合动物组织匀浆后，在醋酸纤维素板上点样、电泳、染色后与标准同工酶谱对比。 3 其他方法：染色体组型、数目等嵌合率的影响因素 供体细胞 （供体细胞发育的全能性、核型的正常与否及遗传背景对种系嵌合率有较大影响。） 受体胚胎 一般来说，导入的受体胚胎越早，其形成嵌合体的嵌合程度越高，但嵌合体的获得率低。 致密化胚胎和胚胎干细胞粘

24、附能力强，有利于形成生殖系嵌合。而未致密化胚胎卵裂球之间未形成紧密连接，在聚合法操作过程中易散失。第四节、细胞核移植技术 一、核移植定义： 通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核放入预先去核的卵母细胞或早期受精卵中，形成一个新的核质重组胚，供体核在受体胞质作用下，发生发育程序重编，使得重组胚得以分裂、分化并最终发育成一个新的个体。 狭义的动物克隆仅指细胞核移植，广义的动物克隆还包括卵裂球分离、胚胎分割。二、核移植技术方法 供体细胞的准备 受体胞质的准备 卵母细胞的去核 重组胚的构建 重组胚的激活 重组胚的培养和胚胎移植 1.供体细胞的准备 供体细胞的要求： 1）正常二倍体细胞，有完整基因组；

25、2）供体核与受体胞质能很好融合并顺利启动分裂和进行发育程序的重编。 供体细胞的类型： 1）胚胎细胞：早期胚胎细胞、ICM 2）胚胎干细胞 3）体细胞 供体细胞的分离方法：略 常用的体细胞： 乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞、卵丘颗粒细胞、输卵管上皮细胞、皮肤成纤维细胞等。 为了便于核移植后的核质融合，供体细胞核移植前往往要进行血清饥饿培养，使之停留于G0期。 2. 胞质受体细胞的类型： M2期卵母细胞、合子期受精卵、2细胞胚胎 其中，M2期卵母细胞是最常用的受体细胞类型，一方面，其重组胚的发育率较高（MPF活性较高），另一方面，M2期的卵母细胞也便于去核操作。 M2期卵母细胞的来源途径：体内成熟、

26、体外成熟 3. 卵母细胞的去核 1）盲吸法：去核率、重组胚发育率高。 2）半卵去核法：胞质损失太多，极少应用。 3）化学诱导去核法：药物处理，核全入PB2. A: 盲吸法去核前M 期卵母细胞 B: 去核后卵母细胞图1 M卵母细胞去核(200)M卵母细胞去核前后H33342荧光染色(100) 4. 重组胚的构建 1）融合法： 灭活仙台病毒诱导融合法：安全性差，极少使用。 电融合法： 常用融合液为0.05MCacl2、0.1M MgSO4的0.3M 甘露糖溶液。 不同细胞融合参数需要摸索。 2）细胞质内注核法 用极细注射针（外径约10um）直接将供体核快速注入受体卵母细胞质内。 此法是体细胞核移植的常用融合方法。 5. 重组胚的激活 受精生物学的研究表明：重组胚的激活关键在于卵母细胞内发生钙离子的振荡。 激活方法： 1）电击法：模仿正常受精过程，多次电脉冲对卵母细胞激活，是目前采用最多的方法。 2）乙醇激活：乙醇IP3信号途径-Ca2+升高 3）Ca2+和Ca2+载体激活：A23187和CHX联合应用，可使胞内Ca2+升高的同时，还可避免第二极体的排出。 4）离子霉素激活 离子霉素也是一种Ca2+载体，当予CB、6-DMAP、CHX等联合应用时，可以有效激活重组胚的发育。 5）Sr2+激活 原理： Sr2+通