质粒酶切鉴定实用教案

1、会计学1质粒酶切鉴定质粒酶切鉴定(jindng)第一页，共36页。1. 实验目的和要求实验目的和要求 学习学习(xux)和掌握限制性内切酶的特和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是，并理解限制性内切酶是DNA重组技术重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 第1页/共36页第二页，共36页。2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水解

2、水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为端修饰酶等一起称为(chn wi)工具酶工具酶。限制性核酸内切酶不仅是。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。切图谱的鉴定。第2页/共36页第三页，共36页。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型(lixng)3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂

3、酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素第3页/共36页第四页，共36页。1) 寄主控制的限制与修饰寄主控制的限制与修饰(xish)现象现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种各种细菌都能合成细菌都能合成(hchng)一种或几种能够切割一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成存在于自身细胞内，但合成(hchng)这种这种酶的细胞自身的酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还不

4、受影响，因为这种细胞还合成合成(hchng)了一种修饰酶，对自身的了一种修饰酶，对自身的DNA进进行了修饰，限制性酶对修饰过的行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。第4页/共36页第五页，共36页。2)限制限制(xinzh)性核酸内切酶的类型性核酸内切酶的类型及特性及特性按限制按限制(xinzh)酶的组成、与修饰酶酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：分为三类： 型型 型型* 型型第5页/共36页第六页，共36页。第一类（第一类（I I型）限制

5、性内切酶能识别型）限制性内切酶能识别(shbi)(shbi)专一的核苷酸顺序，并在识别专一的核苷酸顺序，并在识别(shbi)(shbi)点附近的一些核苷酸上切割点附近的一些核苷酸上切割DNADNA分分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析分析DNADNA结构或克隆基因。这类酶如结构或克隆基因。这类酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第6页/共36页第七页，共36页。第二类第二类(II(I

6、I型型) )限制性内切酶能识别专一的限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是限制性内切酶是DNADNA重组技术中最常用的工重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸，少数也有识个核苷酸，少数也有识别别5 5个核苷酸以及个核苷酸以及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和

7、1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限制性内切酶的识型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向心对称轴，从这个轴朝二个方向“读读”都都完全相同。这种酶的切割可以完全相同。这种酶的切割可以(ky)(ky)有两有两种方式：种方式：第7页/共36页第八页，共36页。粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别

8、顺序为： 5 GAA|TT_C 3 5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“读读”核苷酸顺序都是核苷酸顺序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序（，这就是回文顺序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二个二个DNADNA片段片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷，各有一个单链末端，二条

9、单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及酸二酯键以及(yj)(yj)氢键可通过氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘粘合合”。第8页/共36页第九页，共36页。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置上切型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生割双链，产生(chnshng)(chnshng)平头末端。例如平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位置是：的识别位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。

10、这种末端同。这种末端同样可以通过样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头平头(pngtu)(pngtu)末端：末端：第9页/共36页第十页，共36页。第三类（第三类（ III III型）限制性内切酶也有专一型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定别顺序旁边几个核苷酸对的固定(gdng)(gdng)位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度后产生的一定长度DNADNA片段，

11、具有各种单链片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。末端。因此不能应用于基因克隆。第10页/共36页第十一页，共36页。同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别有时两种限制性内切酶的识别(shbi)核苷酸顺序和切割位置都相核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别同，其差别只在于当识别(shbi)顺顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。性内切酶可以切割，另一种则不能。例如例如Hpa和和Msp的识别的识别(shbi)顺序都是顺序都是5GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只甲基胞嘧啶，则只有有Hpa能够切割

12、。这些有相同切点能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：第11页/共36页第十二页，共36页。有时两种酶切割序列不完全相同，但却有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过同尾酶，可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接酶将这类末端连接起来，但原来连接起来，但原来(yunli)(yunli)的酶切位点的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如切位点。如Xba1Xba1、Nhe1

13、Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同，但均给出相同的序列不同，但均给出相同的“CTAG”“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的了一个新的4 4核苷酸的酶切位点，即核苷酸的酶切位点，即 Bfa1Bfa1的酶切位点。的酶切位点。同尾酶：同尾酶：第12页/共36页第十三页，共36页。4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个用属名的头一个(y )字母和种名的头两字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如个字母表示寄主菌的物

14、种名称，如E. coli 用用Eco表示，所以用斜体字。表示，所以用斜体字。用一个用一个(y )字母代表菌株或型，如流感字母代表菌株或型，如流感嗜血菌嗜血菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如，如Hind, Hind，Hind等。等。第13页/共36页第十四页，共36页。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度(wn

15、d)；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。第14页/共36页第十五页，共36页。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度(md)取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：在琼脂糖中迁移率的

16、因素：DNA分子分子的大小、的大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。第15页/共36页第十六页，共36页。琼脂糖凝的浓度影响给定琼脂糖凝的浓度影响给定(i dn)大小的线状大小的线状DNA的迁移率，因此采用的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的围的DNA片段。片段。0.8%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶能很好地分辨能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的DNA (20-100kb

17、）；对于小片段的）；对于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高浓度或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。定。第16页/共36页第十七页，共36页。EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴苯基菲锭溴盐盐, (Ethidium Bromide), (Ethidium Bromide)。它能够插入。它能够插入DN

18、ADNA分子分子(fnz)(fnz)中的碱基对之间而与中的碱基对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子分子(fnz)(fnz)的插入，在紫的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的外光的照射下，凝胶电泳中的DNADNA条带呈条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 10ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定要注是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。第17页/共36页第十八页，共36页。3. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器质粒质粒 pCMV-Myc-T10

19、pCMV-Myc-T10NEB NEB 标准标准(biozhn)(biozhn)分子量片段分子量片段(1kb DNA (1kb DNA Ladder)Ladder)EcoR1 EcoR1 和和 Xho1 Xho1 核酸内切酶（核酸内切酶（TakaraTakara）EcoR 1EcoR 1和和 Xho 1 Xho 1酶解缓冲液酶解缓冲液(10(10H buffer)H buffer)琼脂糖琼脂糖 TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml) 上样液上样液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚兰，溴酚兰，4040

20、(W/V)(W/V)蔗糖蔗糖(zhtng) (zhtng) 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。第18页/共36页第十九页，共36页。InsertEcoR1Xho11.9kb质粒质粒第19页/共36页第二十页，共36页。第20页/共36页第二十一页，共36页。1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能对不能对DNADNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较(bjio)(bjio)估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g0.5g上样量计。应按上样量计。应按

21、1212条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三倍）：的量是其它片段量的近三倍）： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*第21页/共36页第二十二页，共36页。EcoR I 酶切位点：酶切位点：GAATT_CXho I 酶切位点：酶切位点：CTCGA_G1010H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5)H buffer: 500

22、mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl 100mM MgCl2 2 10mM Dithiothreitol 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl 1000mM NaCl第22页/共36页第二十三页，共36页。酶活性的定义：酶活性的定义：一个活性单位（一个活性单位（U)U)，是指在，是指在5050l l反应体系中反应体系中，37oC37oC的条件下，经过的条件下，经过1 1小时的反应时间，将小时的反应时间，将1 1g DNA g DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因为不同的酶所要求因为不同的酶所要求(yoqi)(yoqi)的最适反应

23、条的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。信息。第23页/共36页第二十四页，共36页。电泳仪，电泳槽，紫外透射电泳仪，电泳槽，紫外透射(tu sh)仪，凝胶成像仪，一次性塑仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等料手套等第24页/共36页第二十五页，共36页。4. 实验实验(shyn)方法和步骤方法和步骤 第25页/共36

24、页第二十六页，共36页。ll（ll） （ll）ll（ll* * 缓冲液随不同缓冲液随不同(b tn)(b tn)的酶而不同的酶而不同(b tn),(b tn),本实验用本实验用 H buffer H buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成小时。酶解完成(wn chng)(wn chng)后后，分别加入，分别加入1010l 3l 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液, , 然后各取然后各取1515l l进进行电泳分析。行电泳分析。1) 质粒质粒DNA的酶解（自提质粒的酶解（自提质粒pCMV-Myc-T10）第26页/共36页第二十七页，共36页。2) 琼脂糖凝

25、胶的制备琼脂糖凝胶的制备(zhbi)琼脂糖凝胶液的制备琼脂糖凝胶液的制备(zhbi)：称取：称取0.8g琼脂琼脂糖，置于三角瓶中，加入糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。第27页/共36页第二十八页，共36页。3）胶板的制备）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干取有机玻璃内槽，洗净、晾干(lin n)；取纸胶条；取纸胶条(宽约宽约1cm)，将有机玻璃，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。 第28页/共36页

26、第二十九页，共36页。将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。玻璃板表面形成均匀的胶层。室温室温(sh wn)下静置下静置30min左右，待凝固左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有机玻璃内槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙乙酸）酸） 或或TBE（Tris-硼

27、酸）工作液的电泳槽硼酸）工作液的电泳槽中使用。中使用。第29页/共36页第三十页，共36页。4）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量(rngling)约约1520 l。1 kb DNA ladder（共（共10条带）条带）: 在第一个在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的的 1 kb DNA ladder（50ng/l ）。）。第30页/共36页第三十一页，共36页。5）电泳（带上手套操作）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳；当溴酚兰移动当溴酚兰移动(ydng)到距离胶板下沿约到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；处停止电泳；将凝胶放入溴化乙啶（将凝胶放入溴化乙啶（EB工作液（工作液（0.5g/ml左右）中染色约左右）中染色约20min。第31页/共36页第三十二页，共36页。为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率片段的最大分辨率，电场强度不应高于，